Файл: Новые методы анализа аминокислот, пептидов и белков..pdf

центрацию противоиона (в данном случае анионов), поскольку при соответствующих рабочих диапазонах pH образуется целый

ряд слабых комплексов ионов с аминокислотами и пептидами. Плесневые грибы, споры и пыль, — все, что присутствует

в буферных растворах, может рассматриваться как загрязнение ионородными частичками. Такие примеси, подобно растворен­ ным газам, могут отфильтровываться на смоле и вызывать рост давления на колонке до такой степени, что она может разру­ шиться. На практике в буферные растворы добавляют ингиби­ торы роста плесени, такие, как каприловая кислота, пентахлорфенол или фенол. Однако было обнаружено, что при добавлении каприловой кислоты появляется неизвестный пик, который со­ впадает с пиком орнитина. Добавление фенола также вызывает появление пика, который повышает фоновую линию в области пары пиков глицин — аланин, анализируемых по методике для белковых гидролизатов. Для предотвращения роста плесневых грибов в бутыль с буфером можно поместить гермицидную УФ-лампу. Площадь неизвестного пика, о котором упоминалось выше, может со временем увеличиваться, что наводит на мысль о том, что, возможно, он обусловлен продуктом разложения каприловой кислоты. Уменьшить образование плесени и удалить другие загрязнения можно путем пропускания свежеприготов­ ленного буферного раствора через фильтр или сохраняя буферы на холоду. Количества реагентов, необходимых для приготовле­ ния таких специальных буферных растворов, приведены в разд. 1.6. Рекомендуемые методики представлены в табл. 2—6 (см. ниже).

При подборе оптимальных элюирующих буферов и их со­ става для хроматографии пептидов возникает ряд новых про­ блем, с которыми обычно не приходится сталкиваться при под­ боре буферных растворов для анализа аминокислот. Для хро­ матографии пептидов исследовались различные буферы [99— 100]. Вначале для анализа пептидов были использованы натрийцитратные или натрийацетатные буферы, описанные Муром и Стейном [2] для хроматографии аминокислот. В этом случае пептиды после их хроматографирования содержат соли. Пеп­ тиды можно также разделять, используя аммонийацетатные или аммонийформиатные буферы, которые удаляются сублимацией [98]. Для разделения пептидов применяли и летучие буферы: пиридин-ацетатные [101] для катионообменной смолы и пири- дин-коллидин-ацетатные [102] для анионобменной смолы. Со­ общалось, что нингидриновая реакция при использовании пири- дин-ацетатных буферов менее чувствительна, по-видимому, из-за

26 ГЛАВА Г

смешении с пиридин-ацетатным буфером; в результате pH смеси приближалось к 5, т. е. к значению, необходимому для опти­ мального развития окраски.

Чистота элюентов, особенно пиридин-ацетатных буферов, важна, когда требуется стабильная фоновая линия, поскольку элюенты могут содержать нингидрин-положительные соедине­ ния (возможно, первичные амины).

В дополнение к краткому описанию буферов для элюирова­ ния аминокислот и пептидов в разд. 1.4 будет уделено особое внимание различным факторам, которые необходимо учитывать при проведении хроматографического анализа. Важность этих факторов обусловлена тем, что условия хроматографии могут влиять на картину разделения аминокислот и пептидов.

1.2.6.Детекторы

Опубликовано много фотометрических методов, применяемых при определении аминокислот и пептидов с помощью хромато­ графии на колонках. Исследовано несколько колориметрических методов. Джейкобс [105, 106] сообщил об использовании стаби­ лизированного реагента индаметрионгидрата для определения аминокислот в пищевых продуктах; для стабилизации окрашен­ ного комплекса применялся 0,08%-ный раствор двухлористого олова. Опубликованы данные об использовании [3-нафтохинон- сульфоновой кислоты и нингидрина [107, 140]. Представляет ин­ терес сообщение об улучшенном кобальт-фенольном реагенте, дающем с аминокислотами и пептидами окраску с максимумом поглощения при 750 нм [108]. Емм и Кокинг [109] изучили реак­ цию аминокислот с нингидрином и установили, что для большин­ ства аминокислот может иметь место стехиометрическая реак­ ция с количественным выходом дикетогидриндилидендикетогидриндамина, который, возможно, является конечным продуктом реакции.

Широко, изучена реакция между а-аминокислотами и нин­ гидрином. Установлено, что окрашенные соединения образуются с аминокислотами, пептидами, белками и другими соединениями, имеющими свободные аминогруппы.

Нингидрин может быть использован для обнаружения кати­ онных комплексов никеля, кобальта и хрома [ПО]. Комплексы никеля и кобальта с этилендиамином дают с нингидрином более интенсивное окрашивание, чем их аммиачные комплексы. При анализе с помощью хроматографии на бумаге они дают окра­ шенные пятна, устойчивые в течение нескольких месяцев.

Руэман [111] показал, что при обработке в водной среде трикетогидринденгидрата (нингидрин) сероводородом обра­ зуется гидриндантин. Гидриндантин растворяется также в кар­

бонате натрия, образуя темно-красный раствор, и выпадает в осадок при добавлении разбавленной соляной кислоты.

Тролл и Каннан [112] установили, что органические раство­ рители— диоксан, этанол, метилцеллозольв, пиридин и фенол — ускоряют развитие окраски в различной степени. При комнат­ ной температуре теоретический выход дают десять из всех обыч­ ных аминокислот. При 100 °С все аминокислоты, за исключением триптофана и лизина, реагируют количественно. Фенол (80%) в абсолютном этаноле и KCN-пиридиновый реагент используются как наиболее эффективные растворители для нингидрин — гидриндантиновой реакционной смеси. Другие аномальные реакции нингидрина описаны Шиллингом с сотр. [113].

Обнаружено, что левулиновая кислота, элюирующаяся . вскоре после начала анализа, дает «нингидрин-положительный пик». Это еще раз доказывает, что нингидрин может быть ис­ пользован для обнаружения не только аминокислот, но и дру­ гих, не содержащих аминогрупп соединений, элюирующихся из колонки аминокислотного анализатора [114].

Захариус и Портер [115] обнаружили по нингидриновой ре­ акции неизвестный пик, который после соответствующего выде­ ления был идентифицирован как смесь фруктозы и глюкозы. Дальнейшие исследования показали, что имеется ряд углеводов и безазотистых соединений, которые дают при аминокислотном анализе нингидрин-положительные пики.

Другие модификации нингидринового реагента были опи­ саны Муром и Стейном [11]. По одной из модификаций исклю­ чается двухлористое олово, которое добавлялось для образова­ ния гидриндантина. В этом случае используют готовый гидриндантин, чтобы предотвратить возможность выпадения солей олова. Блакбурн [34] подробно обсудил химический состав нин­ гидринового и других реагентов на а-аминокислоты, образую­ щих окрашенный продукт (называемый фиолетовая Руэмана), и рассмотрел различные факторы, влияющие на стабильность нингидринового реагента.

При использовании гидриндантина для приготовления реа­ гентов могут возникнуть трудности, связанные с его низкой растворимостью и нестабильностью на воздухе [116]. Розен [117], Найт [118] и Томас с сотр. [119] описали стабильный и приемле­ мый для автоматических методов реагент, при приготовлении

сульфоксид (70:30). Для получения полностью растворимой смеси нингидрина и гидриндантина Мур [121] улучшил состав реагента, заменив метилцеллозольв дшуетилсульфоксидой и

28 ГЛАВА 1

используя литийацетатный буфер вместо натрийацетатного. Ин­ тенсивность окраски при использовании этого реагента на 1— 2% выше, чем те, которые получаются с реагентом, приготовлен­ ным на метнлцеллозольве и натрийацетатном буфере.

При соблюдении рекомендуемых предосторожностей нингидриновый реагент — наиболее чувствительный и воспроизводимый реагент для количественного анализа аминокислот и пептидов. При обычном режиме анализа буферированный нингидриновый реагент добавляется к жидкости, вытекающей из колонки, и затем смесь нагревается при. 100 °С в реакционной бане. Для того чтобы реакция доходила до конца и воспроизводилась, ре­ агент должен содержать минимальное количество гидриндантина, так как он нестабилен на воздухе и плохо растворим в метилцеллозольве. Кроме того, для обеспечения оптимальных ус­ ловий реагент должен быть защищен от света и тепла. Поэтому очень важно, чтобы к нингидриновому реагенту добавлялось точное количество двухлористого олова (которое используется в качестве агента, восстанавливающего эквимолярное количе­ ство нингидрина до гидриндантина). Атмосфера азота в буты­ лях защищает реагент от окисления.

Для количественного определения аминокислот и пептидов по приведенным выше реакциям требуется колориметр или фо­ тометр, с помощью которых обнаруживают изменения в светопоглощении, связанные с протеканием реакций. Поскольку пингидрин наиболее широко используется для обнаружения амино­ кислот и белков, он послужит основой для дальнейшего обсуждения колориметра.

Точные проточные колориметры не являются редкостью в ко­ личественном колориметрическом анализе. Однако примени­ тельно к хроматографии они должны соответствовать следую­ щим требованиям: а) длительная термическая стабильность компонентов; б) исключение утечки жидкости под давлением; в) минимальное перемешивание разделенных на колонке ве­ ществ, обеспечивающее минимальное взаимоналожеиие пиков; г) быстрое удаление пузырьков газа; д) легкость очистки кю­ веты от коллоидных осадков, мешающих прохождению света; е) легкость сборки.

Необходимость длительной термической стабильности коло­ риметра вызвана тем, что процесс снятия хроматограмм может длиться от 0,25 до 6 ч (по некоторым методикам даже 18 ч и более). За такое время нельзя добиться воспроизводимости и обеспечить должную точность ±2,5%, если колориметр не отве­ чает перечисленным выше требованиям. Герметичность кюветы важна для количественного анализа и для идентификации пиков по времени их выхода. Перемешивание потока жидкости в кю­ вете колориметра искажает форму пика. В том случае, когда

два или более пиков разделяются в минимально возможном объеме, перемешивание может нарушить степень разделения.

При реакции (100°С) нингидрин — гидриндантина и амино­ кислот образуется двуокись углерода [104]. При попадании пу­ зырьков этого газа в кювету может нарушиться световой поток. Поэтому пузырьки газа, образующиеся в результате химической реакции или по другим причинам, должны легко и быстро уда­ ляться. По той же причине необходимо удалять из кюветы и коллоидный осадок, образующийся из солей олова и, возможно, метилцеллозольва (см. обсуждение приготовления нингидринового реагента). Плотность таких коллоидных осадков в отличие от плотности пузырьков газа в некоторых случаях настолько высока, что поток буфера не может вымыть их из кюветы. По­ этому при конструировании кюветы всегда нужно учитывать возможность их загрязнения коллоидными осадками.

В случае загрязнения или закупорки кювету необходимо разобрать для чистки. Для облегчения этой простой операции конструкция кюветы должна предусматривать легкость сборки.

Кроме детекторов, предназначенных для количественного анализа аминокислот и пептидов по реакции с нингидрином или другими реагентами, дающими цветную реакцию, были описаны также и другие детекторы. Полярографическое определение ами­ нокислот в виде их медного комплекса основано на образовании из двух молекул аминокислоты и одного иона меди темно-синего комплекса. Этот комплекс пропускают через ячейку полярографа, где определяется количество меди [122]. Аминокислоты можно также определять путем использования динитрофторбензола с последующим фотометрическим определением ДНФ-ами- нокислот при 420 нм [123].

Хыоп и Байер [124] сконструировали детектор для жидкост­ ной хроматографии, который основан на изменении теплоты адсорбции (ДЯ) вещества на ионообменнике. После соответ­ ствующей калибровки он может быть использован для ко­ личественного анализа. Применение этого типа детектора не ограничивается анализом аминокислот или пептидов; его можно приспособить для анализа любых соединений, которые можно разделять, используя жидкостную хроматографию на колонках.

Усовершенствованием ДЯ-детектора является детектор, из­ меряющий осмотическое давление (АР) [125] при прохождении элюируемого вещества через ячейку. Подобно ДЯ-детектору эта система требует постоянства гидравлического давления и термостатирования. Чувствительность ДР-детектора в 3—5 раз выше, чем ДЯ-детектора.

Несмотря на то что АР- и ДЯ-детекторы имеют высокую чувствительность, оба они имеют общий недостаток, который