Файл: Новые методы анализа аминокислот, пептидов и белков..pdf

Скачать файл
Заказать решение

ВУЗ: Не указан

Категория: Не указан

Дисциплина: Не указана

Добавлен: 14.10.2024

Просмотров: 132

Скачиваний: 0

ВНИМАНИЕ! Если данный файл нарушает Ваши авторские права, то обязательно сообщите нам.

Таблица 2

П ЛО ТН О СТИ И ВЯЗКО СТИ Р А ЗЛ И Ч Н Ы Х ВО Д НЫ Х РАСТВОРОВ

 

Состав раствора

Температура. °С

Н20

 

2 0

 

 

 

25

V1 5 M Натрий-калий фосфатный буфер, pH 7,6

2 0

0,05М т р и с - НС1 буфер, pH 7,6

2 0

6

М Гуанидингидрохлорид — 0.1 М

2 0

В-меркаптоэтанол

 

25

6

М Мочевина в Н20

 

25

6

М Мочевина в V1 5 M натрий-калий фосфатном

2 0

 

буфере, pH 7,6

 

 

6

М Мочевина в Н20

и 0.1 М Р-меркаптоэтанол

25

6

М Мочевина в Н20

и 2,0 М NaCl

25

Плотность,

Вязкость.

Литература

г/мл

сП

 

0.9982

1 , 0 0 2

Б70

0,9971

0,894

1,0066*

1,034*

 

0,9997 *

1,037*

 

1,1443*

1,610*

169

1,1465*

1,476*

1,0886

1,254

169

1,0994*

U388*

 

1,0934*

1,270 *

169

1,1631

1,749*

169

6 М Мочевина в Н20 и 0,02 М КН2 Р 0 4

25

1,0973

1,260*

169

* По данным автора главы.

4 1 6 ГЛАВА 10

Z + 1-средний (Afz + i)

и т. д. [уравнение (6)]:

 

М, 2 niM\

п

2 niM*

 

i‘2

п1м1

мZ + 1

2 niM\

(6 )

Если образец совершенно гомогенен, то все средние молекуляр­ ные веса равны, М„ = Я г0 — Mz. Если образец гетерогенен, то

М п <С M w < M z .

10.2.7.2.Малеилирование

Малеиновый ангидрид имеет много достоинств как реагент, обратимо блокирующий аминогруппы белков и пептидов. Введе­ ние отрицательного заряда (инкремент —2 на одну реактивную аминогруппу), согласно уравнению (7), представляет собой среднюю процедуру, которая способствует повышению раствори­ мости полипептидов при нейтральном pH. Эта реакция специ­ фична для аминогрупп и обратима в мягких условиях.

— NHJ.+ V?С / I ^ — NH—Сч—СН =СН —СО О '+ 2Н+

(7)

сн

 

Белки, состоящие из нескольких полипептидных цепей, после малеилирования легко и мягко диссоциируют при нейтральном или близком к нейтральному значению pH на хорошо раствори­ мые полипептидные цепи, поскольку преобладание зарядов од­ ного знака значительно усиливает электростатическое отталки­ вание цепей и минимизирует вероятность ассоциации (например, метионилтрансфер-РНК-синтетаза [138], альдолаза, трансальдолаза, фруктозодифосфатаза [139], глюкозо-6-фосфатдегидроге- наза [140]) (см. также [83] и [141]). После малеилирования дена­ турированные белки становятся растворимыми при pH 8 в от­ сутствии гуанидингидрохлорида или мочевины.

Связь малеил — аминогруппа очень стабильна при значении pH выше 6, но легко гидролизуется ниже pH 5 (полупериод рас­ пада е-малеиллизина равен 11 ч при 37 °С и pH 3,5 [141]). Такие умеренные требования к гидролизу сводят до минимума опас­ ность расщепления любой пептидной связи цепи. Следовательно, малеилирование является удобным способом «обратимого» бло­ кирования аминогрупп; обработка малеил-производного альдолазы мышц кролика при pH 4,5 и температуре 25 °С в течение 40 мин в присутствии дитиотреитола при концентрации 10-3 М приводила к потере половины остатков маЛеила и восстановле­ нию 46% ферментативной активности. Установлено также, что

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЧЕТВЕРТИЧНОЙ СТРУКТУРЫ БЕЛКОВ

417

большинство белков реассоциирует при этом, например, до

тетрамера.

Диссоциация на полипептидные цепи при малеилировании, по крайней мере в ряде случаев, происходит при включении в белок относительно небольшого количества остатков малеила. Например, только 15% общего количества остатков лизина, а именно 16 остатков лизина молекулы альдолазы, реагирует с малеиновым ангидридом [139]. Их присоединение не изменяет молекулярного веса в сколько-нибудь значительной степени и поэтому может не учитываться при расчете молекулярного веса.

Седиментационное исследование обычно является тестом на диссоциацию многоцепочечных молекул белков, обработанных малеиновым ангидридом. Если происходит диссоциация, то коэффициент седиментации заметно снижается по величине, на­ пример, от 7,68 S до 1,71 S для альдолазы мышц кролика, от 6,2 S до 1,7 S для альдолазы шпината, от 7,04 S до 2,04 S для фруктозодифосфатазы печени кролика, от 4,18 S до 1,34 S для трансальдолазы [139] и от 9,3 S до 3,4 S для глюкозо-6-фосфат- дегидрогеназы [140]. Снижение коэффициента седиментации еще не обязательно указывает на наличие диссоциации, потому что сильно заряженные белковые молекулы характеризуются замет­ ной зависимостью седиментации от эффекта заряда. Поэтому изучение седиментации сильно заряженных макромолекул про­ водят в растворах с повышенной ионной силой (вплоть.до 1). Кроме того, денатурация может приводить к раскручиванию полипептидных цепей, что также вызывает снижение коэффи­ циента седиментации. Если обработка малеиновым ангидридом не дает достаточной степени гомогенности, можно проделать повторное малеилирование или разделить продукты диссоциа­ ции гель-фильтрацией на сефадексе G-100 [140].

Определение молекулярного веса должно быть проведено в пределах нескольких дней с момента малеилирования, поскольку малеил-производные. со временем начинают проявлять тенден­ цию к реассоциации (неспецифической?) и, следовательно, к об­ разованию компонентов с высокими молекулярными весами.

Процедура малеилирования (на примере метионилтрансфер- РНК-синтетазы [138]) выглядит следующим образом: перекристаллизованный малеиновый ангидрид добавляют в количестве 2,5 мг (30-кратный избыток по всем свободным аминогруппам) к 200 мкл раствора белка (1,5 мг) в 0,5 М боратном буфере, pH 9,5 и инкубируют в течение часа при комнатной температуре. Затем делают диализ против 0,1 М фосфатного буфера, pH 7, со­ держащего 0,4—1,0 М NaCl. В ходе процесса реакция раствора неизменно поддерживается при pH 8,5—9,5 добавлением 0,1 н. щелочи. Малеиновый ангидрид можно добавлять к белку не только в сухом виде, но и растворенным в бензоле.

14 Зак. 26

418

ГЛАВА 10

Чтобы избежать неточностей, присущих определению молеку­ лярных весов белков в 8М мочевине или 6М гуанидиигидрохлориде, белки, содержащие SH-группы (например, алкогольдегидрогеназа печени или дрожжей, глицеральдегид-3-фосфатдегидро- геназа [83]), могут быть предварительно карбоксиметилированы, а затем малеилированы [83]. Раствор карбоксиметилированного белка в мочевине или гуанидингидрохлориде доводят до pH 9 прибавлением 0,1 н. NaOH и затем проводят реакцию с малеи­ новым ангидридом при двадцатикратном избытке последнего относительно общего количества аминогрупп, при реакции раствора pH 8,5—9,0, поддерживаемой с помощью 0,1 н. NaOH. По завершении реакции малеилирования раствор белка тщательно диализуют против 0,5% (вес/объем) бикарбоната аммония; окончательный диализ проводят против буфера с до­ бавлением хлористого натрия до концентрации 0,4 М.

10.2.7.3.Сукцинилирование

Реакция белка с сукциновым ангидридом [142] или с его про­ изводными, например тетрафторсукциновым ангидридом [143], именуется сукцинилированием

с—сн.

—NHJ + О;\с—сн.

—NH—СО—СН2—СН2—СОО~+ 2Н+ (8)

О

 

Она аналогична реакции

ацилирования при малеилировании.

В зависимости от молярного соотношения добавленного реа­ гента и числа свободных аминогрупп белка число вводимых в

молекулу белка групп сукцинила может варьировать от немно­ гих до максимального, равного числу свободных аминогрупп. Реагент проявляет сильное сродство к аминогруппам, хотя при определенных условиях также способен реагировать с гидро­ ксильными и сульфгидрильными группами.

Процедура сукцинилирования (на примере каталазы [54])

следующая: к 15—18 мг каталазы в 1 мл 67 мМ фосфатного бу­ фера pH 7,6 добавляют 10 мг твердого сукцинового ангидрида; через 10—30 мин добавляют еще 10 мг сукцинового ангидрида. При этом раствор непрерывно перемешивают, а pH поддержи­ вают в интервале от 7,6 до 8 добавлением 0,5 н. NaOH. После двух часов инкубации при комнатной температуре раствор диа­ лизуют против фосфатного буфера. Аналогичное исследование белка в ультрацентрифуге показывает, что при достаточном ко­ личестве сукцинового ангидрида в растворе присутствует только компонент, соответствующий полипептидной цепи (рис. 12). При

Смотрите также файлы