Файл: Новые методы анализа аминокислот, пептидов и белков..pdf

Если процесс денатурации идет в отсутствие меркаптоэтанола, то создается возможность окисления свободных SH-rpynn до дисульфидных мостиков, ковалентно связывающих полипептидные цепи. Этим можно объяснить тот факт, что обработка каталазы гуанидингидрохлоридом без меркаптоэтанола не при­ водит к снижению ее молекулярного веса, он равен 144 000 вме­ сто 59 000 в присутствии меркаптоэтанола [54].

При концентрации гуанидингидрохлорида ниже 5М диссоциа­ ция белков до полипептидных цепей может быть неполной. На­ пример, при возрастании концентрации гуанидингидрохлорида от

в 5М гуанидингидрохлориде с 0,1 М меркаптоэтанолом [54].

Фотографии сделаны через 46 и 78 мин после достижения скорости 59 780 об/мин. Опыт проводили в границеобразующей кювете клапанного типа. Угол наклона фазовой диа­ фрагмы 60°. Растворитель—67 мМ калий-натриевый фосфатный буфер, pH 7,6. Темпе­ ратура 20 °С.

0,25 до 2,0 М (в присутствии 0,1 М р-меркаптоэтанола при pH 6,3 и температуре 20 °С) коэффициент седиментации АТФ-креа- тинтрансфосфорилазы, изменялся от 5,1 до 1,9 S. При кон­

центрации гуанидингидрохлорида 0,25 М и ниже (в20и) = 5,1 S,

что характерно для ассоциированной формы молекулы; натив­ ный фермент имеет коэффициент седиментации $!>„ ш = 5,3 S'),

а также выше 2,0 М в растворе имеется только по одному компо­ ненту (полностью ассоциированная и полностью диссоциирован­ ная, 1,4 S, формы молекулы соответственно). В промежуточном диапазоне концентраций система, кроме того, проявляла тенден­ цию к образованию агрегатов с коэффициентами седиментации вблизи 20 S [148].

Оценка молекулярного веса требует знания удельного парци­ ального объема белка, v. Точность установления этой величины в значительной мере оказывает влияние на точность нахождения молекулярного веса. Опубликованные в научной литературе дан­ ные относительно влияния концентрированного гуанидингидро­ хлорида на величину v противоречивы. Кажущийся удельный парциальный объем ряда белков не изменяется или только слабо уменьшается в присутствии гуанидингидрохлорида; есть основа­ ние считать, что v для белков в 6 М гуанидингидрохлориде

вообще не сильно отличается от той же величины в разбавлен­ ных водных солевых растворах (ср. табл.З и работы [149—152]). Однако предположение о преимущественной гидратации попрежнему часто используется при учете отклонений, и, следо-

Таблица 3

УДЕЛЬНЫЙ ПАРЦИАЛЬНЫЙ ОБЪЕМ БЕЛКОВ и В НАТИВНОМ СОСТОЯНИИ И В РАСТВОРАХ ГУАНИДИНГИДРОХЛОРИДА ПРИ 25 °С

вательно, если представляется возможность, необходимо дока­ зывать, изменяется ли v белков в растворах гуанидингидрохлорида. Высокая плотность концентрированного раствора этого соединения по сравнению с разбавленными буферными раство­ рами при неточном определении приводит к получению довольно больших ошибок в члене (1 — пр) уравнения Сведберга и, сле­ довательно, в молекулярном весе. Например, отклонение v на 0,01 мл/г вызывает ошибку в 7% при определении молекуляр­ ного веса с использованием 5 М гуанидингидрохлорида; при применении буферного раствора ошибка составляет только 3%.

Измерение вязкости растворов полипептидных цепей при вы­ сокой концентрации гуанидингидрохлорида с р-меркаптоэтано- лом показывает, что характеристическая вязкость [т]] зависит от молекулярного веса таким образом, как это предсказывает тео­ рия для полимерных цепей в конформации статистического клуб­ ка [137, 146]. Молекулярный вес можно оценить по следующему уравнению:

где п — число мономерных единиц (аминокислотных остатков) на цепь; Мо — средний молекулярный вес мономерной единицы; К', К." к а — константы. Последняя константа имеет значения в интервале 0,5—0,8 для статистических клубков. Для полипептид­

соответствующего белку, будет наблюдаться так называемый солевой дополнительный градиент, происходящий от различия концентраций гуанидингидрохлорида в растворе с белком и в растворителе, используемом для создания искусственной границы.

Очистка гуанидингидрохлорида [156]

Перед использованием гуанидингидрохлорид следует перекристаллизовывать следующим образом: 250 г соли растворяют в 1 л горячего абсолютного этанола, раствор пропускают через активированный уголь для обесцвечивания и в случае необходи­ мости фильтруют на большой воронке с подогревом. К горячему раствору затем добавляют 500 мл бензола, смесь охлаждают и выдерживают на холоду в течение нескольких часов, прежде чем приступить к отделению игольчатых кристаллов гуанидин­ гидрохлорида. Иногда образуется желтая густоватая примесь в исходном образце, которую можно отмыть ацетоном.

Перекристаллизованный таким образом гуанидингидрохлорид обычно подвергают дополнительной перекристаллизации либо из почти кипящего метанола с последующим охлаждением смесью сухой лед — ацетон, либо из воды упариванием под вакуумом почти насыщенных при 40 °С водных растворов гуанидингдирохлорида. Окончательное высушивание кристаллов проводят в ва­ куум-эксикаторе над Р2О5.

Другой метод состоит в нейтрализации густой массы кристал­ лов гуанидинкарбоната после перекристаллизации из 50% эта­ нола, очищенной 10%-ной соляной кислотой pH 4,0. Раствор упаривают до получения кристаллов гуанидингидрохлорида. Ко­ нечный продукт довольно чистый, но по-прежнему требует пере­ кристаллизации, как описано ранее.

Критерии чистоты гуанидингидрохлорида хорошо известны: 1) спектр поглощения света 6 М раствора характеризуется по­ степенным увеличением поглощения с отсутствием пика в интер­ вале от 350 до 230 нм, после чего происходит резкое увеличение оптической плотности до 0,15 оптических единиц при длине вол­ ны 225 нм; 2) незначительные количества стандартных растворов кислоты или щелочи вызывают большой сдвиг pH раствора гуа­ нидингидрохлорида.

10.2.8.Равновесие ассоциации — диссоциации

При физиологических условиях белковые молекулы ведут себя обычно как монодисперсные вещества с определенным мо­ лекулярным весом, хотя, как следует из предыдущих разделов, большинство белков состоит более чем из одной полипептидной цепи. Однако в некоторых случаях между мономерами и поли­ мерами устанавливается равновесие, именуемое равновесием ас­