Файл: Новые методы анализа аминокислот, пептидов и белков..pdf

4 0 4 ГЛАВА 10

Некоторые дегидрогеназы обладают свойствами, отличаю­ щими их от ферментов приведенного выше типа. Рассмотрим три примера: малатдегидрогеназа Neurospora crassa имеет молеку­ лярный вес 54 000, состоит из четырех полипептидных цепей («со­ став» а 3р, три цепи идентичны) и содержит только один участок, связывающий кофермент [85]. При pH 2,8 наблюдается инактива­ ция фермента, сопровождающаяся диссоциацией на аз-субъеди­ ницы и р-полипептидную цепь, которые при pH 6,8 реассоциируют до ферментативно активного тетрамера а 3|3. Изоцитратдегидрогеназа Azotobacter vinelandii имеет молекулярный вес 80 000 и не диссоциирует в 6М гуанидингидрохлориде [86]. Неко­ торые дегидрогеназы, например глутаматдегидрогеназа печени быка, обладают, кроме активного центра, еще дополнительным центром связывания субстрата (пуриннуклеотида). У таких де­ гидрогеназ число участков, связывающих кофермент, может быть больше числа полипептидных цепей.

Для оценки числа пиридиннуклеотид-связывающих участков используются следующие прямые методы.

10.2.6.1.Абсорбционная спектрофотометрия [87]

Этот метод основан на спектральных различиях растворов некоторых ферментов, в данном случае дегидрогеназы, и соответ­ ствующих коферментов; эти различия можно использовать для спектрофотометрического титрования.

Кофермент НАД-Н имеет характеристическую полосу погло­ щения при длине волны 340 нм (так называемая «дигидро-по- лоса») [88]. Максимум ее сдвигается в присутствии алкогольдегидрогеназы (из печени лошади и человека) или лактатдегидрогеназы (из сердца быка и печени крысы) [45] от 340 к 325 нм. Спектрофотометрический анализ связывания НАД-Н с фермен­ том ограничивается дегидрогеназами из указанных выше источ­

ников, потому что другие пиридиннуклеотид-зависимые дегидро-

^назы. «ксдедвванные т ж под., т ц$швдми такого одома

дигидро:полосы поглощения. Однако максимум характеристиче­ ского поглощения примесных соединений — НАД+ и аналогов НАД+ с цианидами, гидроксиламином, сульфитом и сульфгидрильными соединениями, структурно подобными субстрату, — сдвигается в более коротковолновую область при связывании с рядом пиридиннуклеотид-зависимых дегидрогеназ, не дающих сдвига в спектре при связывании с НАД-Н. Эти вещества могут рассматриваться как дигидропиридиновые соединения и, следо­ вательно, как аналоги молекулы восстановленного кофермента. Бинарный фермент-коферментный комплекс дрожжевой d - г л и - церальдегид-3-фосфатдегидрогеназы с НАД+ был проанализиро­ ван с использованием метода измерения разностных спектров этого комплекса (рис. 6, работа [89]).

А

J _____________ L

5 10

Концентрация НАД*, 10~2люль/л

Рис. 6.

температура 20° С. е рассчитывается на моль связывающих участков при четырех связы­ вающих участках в молекуле фермента (М 140 000).

кул НАД"*" с молекулой дегидрогеназы из мышц млекопитающих не приводило к измеиеаню поглощения [90].

Длина волны, нм

гольдегидрогеназой печени лошади. Спектр поглощения фермент-кофер- ментного комплекса приведен с учетом поглощения алкогольдегидрогеназы. В спектры флуоресценции введена поправка на влияние растворителя (без коррекции спектральной чувствительности прибора). Интенсивность флуорес­ ценции выражена в произвольных единицах [91].

Концентрация НАД-Н, мкмоль/л

10.2.6.2.Флуоресцентная спектрофотометрия [45,87,88,91—93]

Молекулы НАД-Н (а также НАДФ.-Н) флуоресцируют в от­ личие от НАД+ (и НАДФ+) при облучении светом с длиной вол­ ны 340 нм. При образовании комплексов с пиридиннуклеотидзависимыми дегидрогеназами максимум флуоресценции НАД-Н сдвигается в более коротковолновую область и в большинстве случаев возрастает в несколько раз (рис. 7). При связывании с НАД-Н или НАД+ флуоресценция фермента тушится.

Изменения интенсивности флуоресценции при связывании кофермента с ферментом используются в методе флуориметрического титрования для оценки числа участков на молекуле фер­ мента, связывающих кофермент (рис. 8).

Определение К е , r и числа связывающих участков графиче­ ской экстраполяцией (по данным рис. 8) справедливо только для величин Ке, н а д -н не превышающих 10_6 М. В противном слу­ чае необходимо учитывать, что при низких концентрациях кофермента только часть его связывается с ферментом, и, следователь­ но, начальный наклон кривой титрования следует исправлять на величину количества свободного кофермента.

Если флуориметрический метод применяется для исследова­ ния конкурентного связывания НАД+ и НАД-Н согласно уравне­ нию (2), то необходимо учитывать, что НАД+ в какой-то мере снижает наклон Е—НАД-Н/НАД-Н [95]:

Е -Н А Д -Н + НАД+ Е—НАД+ + НАД-Н (2)

10.2.6.3.Дисперсия оптического вращения и круговой дихроизм [96—98]

При связывании НАД-Н дисперсия оптического вращения алкогольдегидрогеназы становится аномальной благодаря появ­ лению одного, ярко выраженного отрицательного эффекта Кот­ тона [96]. Этот необычный в данном случае эффект происходит в результате образования оптически активного комплекса между ферментом и коферментом. Асимметрическое связывание хромо­ форной молекулы с молекулой нативного белка-фермента инду­ цирует появление оптически активной полосы поглощения хромо­ фора. Точка перегиба на графике, иллюстрирующем эффект Кот­ тона алкогольдегидрогеназы печени лошади при длине волны 327 нм, соответствует близко расположенному максимуму погло­ щения комплекса фермент — НАД-Н. Стехиометрия связывания НАД-Н или аналогов кофермента с алкогольдегидрогеназой пе­ чени может быть количественно оценена путем титрования с по­ мощью метода дисперсии оптического вращения, используя измеценце амплитуды эффекта Коттона после добавления НАД-Н