Файл: Новые методы анализа аминокислот, пептидов и белков..pdf

Скачать файл
Заказать решение

ВУЗ: Не указан

Категория: Не указан

Дисциплина: Не указана

Добавлен: 14.10.2024

Просмотров: 125

Скачиваний: 0

ВНИМАНИЕ! Если данный файл нарушает Ваши авторские права, то обязательно сообщите нам.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЧЕТВЕРТИЧНОЙ СТРУКТУРЫ БЕЛКОВ

429

социации — диссоциации. При этом мономер может представлять собой одну полипептидную цепь (химотрипсин [157, 158], гемэритрин [159]) или субъединицу, состоящую более чем из одной полипептидной цепи (глутаматдегидрогеназа [9, 10]).

Предложено несколько механизмов равновесия ассоциации — диссоциации [2, 3, 5, 9]. Среди них имеется два предельных слу­ чая: а) замкнутое (одноступенчатое) равновесие ассоциации — диссоциации без образования промежуточных соединений [урав­ нение (10), в котором Mi — мономер] и б) открытое равновесие ассоциации — диссоциации с последовательным присоединением мономеров без ограничения, согласно уравнению (11), и с одина­ ковыми константами равновесия на каждом этапе.

 

п М

п

K l , n =

[ M n ]

(Ю)

 

+ М п ,

[ M , ] "

 

 

 

 

 

 

M i +

М ,

 

м 2

Kl , 2

[ M 2]

 

 

[Mil2

 

 

 

 

 

 

 

М 2 +

M i

^2, 3

м3

K 2,Z

[ M 3]

 

 

 

 

 

 

[ M 2] [ M , ]

(П)

 

 

1 4

м 4

 

[М4]

 

 

 

 

M 3 +

M i

K 3,A

[М3] [ M i ]

 

 

 

г+

Мг+1

АГг'г-и

[M / + i 1

 

M i +

M l

:

ГЛ/f.l ГЛ/Г.1

 

В других случаях константы равновесия могут быть различными, т. е. одна константа характеризует димеризацию, вторая — все остальные этапы. Между этими предельными случаями возмож­ но большое число специальных случаев, например, после образо­ вания димеров из мономеров в дальнейшем ассоциируют только димеры.

Исследование равновесия ассоциации — диссоциации обычно проводят методами седиментационного равновесия и измерения светорассеяния, однако возможно также использование методов осмотического давления и хроматографии на молекулярных си­ тах. Способы интерпретации экспериментальных данных описаны рядом авторов [2, 3, 5, 6 и 160—164]. В .настоящее время путь выяснения истинного механизма ассоциации заключается в срав­ нении экспериментальных данных с кривыми, рассчитанными для различных модельных механизмов.

Примером замкнутого равновесия ассоциации — диссоциации может служить гемэритрин (в форме комплекса с азидом) из Golfingia gouldii. По данным седиментационного равновесия константа равновесия для ассоциации — диссоциации между мо­

430

ГЛАВА 10

 

номерами и октамерами

оказалась равной

3,4-1036 М-7 при

5 °С [159].

 

 

8М, ,=fc

М8 ^ .8 = - ^

(12)

Равновесие ассоциации — диссоциации для глутаматдегидрогеназы печени быка может быть описано как открытое

|Il |JLl||Ajl1|jLi|]ju |

I''

II'•II ■II

II

I

Рис.

15. Седиментационные диаграммы глутаматдегидрогеназы печени быка

в 67

мМ

калий-натриевом фосфатном

буфере при pH

7,6 и температуре

 

 

 

 

20 °С [165J.

 

 

Скорость вращения ротора 50 740 об/мин, угол наклона фазовой диафрагмы 65°;

границе­

образующая кювета клапанного типа; интервалы между седнментационнымн

диаграм­

а —концентрация белка 8.39 мг/мл

мами 2 мин.

 

 

(наслоен

раствор того же белка с концентрацией

5,59 мг/мл);

6 —концентрация

белка

5,60 мг/мл (наслоен раствор

того же белка с кон­

 

 

 

центрацией 3,73 мг/мл).

 

 

равновесие согласно

уравнению

(11). Этот фермент проявляет

аномальное седиментационное поведение. Пик градиента кон­ центрации не симметричен (на рис. 15, а и б даны кривые для растворов белка с низкой концентрацией), на стороне пика, об­ ращенной к растворителю, имеется «хвост», отстающий при се­ диментации от максимума пика. При концентрациях белка ниже 5 мг/мл коэффициент седиментации снижается с уменьшением концентрации белка [166, 167]. Эти аномалии происходят благо­ даря диссоциации молекул фермента на субъединицы. Появле­ ние отстающего «хвоста» при седиментации обусловлено умень­ шением концентраций белка на переходе через границу между раствором и растворителем, соответствующим распределению концентрации в кювете ультрацентрифуги. Это способствует дальнейшей диссоциации в ходе центрифугирования. Рис. 15 свидетельствует о том, что диссоциация при седиментации мо­ жет быть исключена, если опыт проводится в границеобразую­ щей кювете, с наслоением на раствор глутаматдегидрогеназы не чистого буфера (растворителя), а раствора того же фермен­ та, но с более низкой концентрацией. В этом случае граница

Рис. 16. Радиус инерции поперечного сечения молекулы (Rq) и масса на

1 А длины частиц глутаматдегидрогеназы (M/lA) как функции концентра­ ции белка [8].

Растворитель—67 мМ калнй-натриевый фосфатный буфер. pH 7,6.

Рис. 17. Длина частиц глутаматдегидрогеназы как функция молекулярного веса [8].

Растворитель—67 мМ калий;натрневый фосфатный буфер, pH 7,6.

432

ГЛАВА 10

образуется между растворами глутаматдегидрогеназы с раз­ ными концентрациями, и пик градиентной кривой будет симмет­ ричен. В верхней же части наслоенного раствора в процессе седиментации образуется граница между раствором и раствори­ телем (идентичная границе при обычном способе наслоения растворителя на раствор), и градиент концентрации в этой об­ ласти кюветы становится несимметричным.

На основании данных измерения диффузии, седиментации и вязкости был сделан вывод, что молекула глутаматдегидроге-

Рис. 18. Зависимость средневесового молекулярного веса глутаматдегидро­ геназы от концентрации белка [9].

Растворитель—67 мМ

калнй-натриевый

фосфатный буфер, pH 7,6. Температура 20 °С.

(+) —светорассеяние

при 436 им для с

> 8 мг/мл,

экстраполированное при А->оо. Кри­

вые рассчитаны для случая открытого

равновесия

ассоциации—диссоциации, согласно

уравнению (11) при Kit i+1 = I,l ■10а М- 1 , М, 310 000, А2= 8 • Ю- 9 [моль-л/г2] М ^ каж .).

Кривая U w (истин.) построена без учета второго внриального коэффициента.

назы в состоянии ассоциации имеет вытянутую форму, а диссо­ циация приводит к поперечному ее расщеплению [165, 167]. Это заключение подтверждено измерениями рассеяния рентгеновских лучей под малыми углами [8] (ср. с работой [10]). Радиус инер­ ции поперечного сечения молекулы и масса на единицу длины молекулы не зависели от концентрации белка, а следовательно, от молекулярного веса (рис. 16). В полном согласии с этим было получено линейное соотношение между длиной частиц глутамат­ дегидрогеназы и их молекулярными весами (рис. 17).

Зависимость молекулярного веса от концентрации белка ис­ следовалась при измерениях светорассеяния [9, 10]. На рис. 18 показано, что молекулярные веса достигают максимума при кон­ центрации около 9 мг/мл. При дальнейшем увеличении концен­

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЧЕТВЕРТИЧНОЙ СТРУКТУРЫ БЕЛКОВ

433

трации молекулярные веса уменьшаются. Увеличение молекуляр­ ного веса при концентрациях белка ниже максимума можно приписать процессу самоассоциации, однако уменьшение моле­ кулярного веса при более высоких концентрациях не может быть за счет констант равновесия, всегда имеющих положительный знак. Таким образом, снижение молекулярных весов происходит благодаря эффектам неидеальности. С учетом второго вириального коэффициента (А2 = 8-10-9 моль-л/г2) экспериментальные данные можно проанализировать по механизму открытого равновесия ассоциации — диссоциации по уравнению (11) с константами равновесия, одинаковыми для всех этапов (Ki,i+i = = 1,1 • 106 М-1) и без ограничения степени ассоциации. Теорети­ ческая кривая, рассчитанная с использованием молекулярного веса мономера Mi 310 000 * и с учетом второго виртуального ко­

эффициента, согласно уравнению (13) (кривая Mw(каж.) на рис. 18), хорошо согласуется с экспериментальными данными. Вторая кривая на рис. 18 рассчитана без учета второго вириального коэффициента. Эта кривая

1/Mw (каж.) = l/Mw (истин.) + 2Аго,

(13)

(где с — концентрация белка в мг/мл) представляет зависи­ мость истинного средневесового молекулярного веса от концен­ трации.

Видимо, указанный механизм является единственно обосно* ванным, потому что ассоциированная молекула образуется взаимодействием концевых групп субъединиц, что приводит к образованию палочкоподобных частиц. Замкнутое равновесие ассоциации — диссоциации по уравнению (10) исключается.

Интересно отметить, что свойства глутаматдегидрогеназы пе^ чени свиньи и печени быка очень похожи. Эти два фермежГа из различных источников могут образовывать гибридные ассоцииро­ ванные частицы чисто статистическим образом [168]. Следова­ тельно, контактные участки этих ферментов одинаковы или по* добны.

10.3.З А К Л Ю Ч И Т Ё Л Ь Н Ы Е ЗА М Е Ч А Н И Я

Выяснение четвертичной структуры определенного белка яв* ляется не ±акой простой задачей, как может показаться. Обычно используемые методы не всегда дают однозначные ответы. Воз­ никающие при анализе трудности объясняются тем, что а) при использовании химических методов невозможно получить коли­ чественный выход; б) Диссоциация может быть нейолной; в) де*

* Мономер (А4 3i0000) и ассоциированные частицы ферментативно ак­ тивны.

15 Зак, 25

434

ГЛАВА 10

натурированные белки часто исследуются в растворах, которые нельзя считать идеальными (эффекты неидеальности часто зна­ чительны и время от времени пересматриваются); г) при усло­ виях используемых обработок белка может гидролизоваться пеп­ тидная связь. В последнем случае число обнаруживаемых полипептидных цепей слишком велико, тогда как в случаях (а) и (б) исследователь сталкивается с противоположной тенденцией. Несомненно, что ограничивающим фактором при определении молекулярных весов является степень гомогенности исследуе­ мого материала.

Чем больше различие' между молекулярными весами натив­ ной белковой молекулы и полипептидных цепей, тем больше воз­ никает трудностей при точном определении числа полипептидных цепей, составляющих эту молекулу. Наилучшим способом до­ стижения точного и однозначного ответа является сочетание ряда различных методов.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

 

1.

Reithel F.

Advan. Protein Chem., 18, 123 (1963).

in «The Proteins»,

2.

Nichol L. IF., Bethune I. L., Kegeles G., Hess E. L.,

 

Vol. 2, 2nd ed„ Ed. by H. Neurath, Academic Press, New York and Lon*

3.

don, 1964, p. 305.

287 (1964).

Casassa E. F., Eisenberg H., Advan. Protein Chem., 19,

4.Sund H., Weber K-, Angew. Chem., 78, 217 (1966); Angew. Chem., Intern. Ed., 5, 231 (1966).

5.Elias H. G., Bareiss R., Chimia, 21, 53 (1967).

6.Adams E. T., Fractions, No. 3, Spinco Division of Beckman Instruments Inc., Palo Alta, California, 1967.

7.Engstrom A., Strandberg B. (eds.) Symmetry and Function of Biological

Systems at the Macromolecular Level, Almqvist and Wiksell, Stockholm; and John Wiley, New York, London, 1969.

8. Sund H., Pilz /., Herbst M., European J. Biochem., 7, 517 (1969).

9.Krause J., Markau K., Minssen AL, Sund H., in «Pyridine Nucleotide-De­ pendent Dehydrogenases», Ed. by H. Sund, Springer-Verlag, Heidelberg and New York, 1970, p. 279.

10.Eisenberg H., in «Pyridine Nucleotide-Dependent Dehydrogenases», Ed. by

H. Sund, Springer

Verlag,

Heidelberg — New

York, 1970, p. 293.

11. Kakiuchi K-, J. Phys. Chem., 69, 1829 (1965).

in «The Enzymes», Vol. 1,

12. Linderstrom-Lang

K. U.,

Schellman J. A.,

2n ed„ Ed. by P. D. Boyer, H. Lardy and Marbick, Academic Press. New York, 1959, p. 443.

13.Bernal J. D,, Discus. Faraday Soc., 25, 7 (1958).

14.Pauling L., Corey R. B„ Fortschr. Chem. Org. Naturstoffe 11, 180 (1954); Pauling L., The Nature of the Chemical Bond, 3rd ed., Cornelle Univef* sity Press, Ithaca, New York, 1960, p. 498.

15.Kendrew J. C., Angew. Chem., 75, 595 (1963).

16.Perutz M. F., Angew. Chem., 75, 589 (1963); Sci. Am..211, No. 5, 64 (1964).

17.Monod J., Wyman J., Changeux I. P., J. Mol. Biol., 12, 88 (1965).

18.Kauzmann W., Advan. Protein Chem., 14, 1 (1959).

19.

Scheraga H. A., in «The Proteins», Vol. 1, 2nd ed., Ed. by H, Neurath,

•

Academic Press, New York, 1963, p. 477.

Смотрите также файлы