Файл: Пальм, В. А. Введение в теоретическую органическую химию учеб. пособие.pdf

По аналогии с карбоксильными кислотами, рассмотренную реак­ цию ацилирования катализируют также амиды кислот.

Если в качестве ацилирующего агента применять ангидрид карбок­ сильной кислоты, наблюдается автокатализ, поскольку каталити­ чески активная карбоксильная кислота образуется в ходе реакции:

R — NH2+ R ' — СО— О — СО— R' R - N H - C O - R ' + R'-CO O H

Присутствие в одной молекуле каталитически активных основного (нуклеофильного) и кислотного центров моделирует действие фермен­ тов в качестве общих кислотно-основных катализаторов.

4. ОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫ ДЕЙСТВИЯ ФЕРМЕНТОВ

Ферментами, или энзимами, называются катализаторы, обеспе­ чивающие протекание всевозможных биохимических реакций в живых организмах. Все без исключения ферменты относятся к классу белков. В одних случаях ферментативная активность присуща простым бел­ кам — протеинам, состоящим только из полипептидных цепей. Дру­ гие простые белки — апоферменты — проявляют каталитическую ак­ тивность лишь в присутствии определенных органических промото­ ров, называемых коферментами. Встречаются среди ферментов также сложные белки, протеиды, состоящие из полипептидной части, соеди­ ненной с так называемой простетической группой, относящейся к дру­ гим классам соединений. Существуют ферменты, активные только в присутствии определенных ионов, обычно ионов металла, называемых

ионным кофактором.

Отличительными чертами ферментов являются их исключительно высокая каталитическая активность и специфичность действия. Под специфичностью понимается резкая зависимость скорости реакции от особенностей строения субстрата. Помимо уже знакомых из преды­ дущих глав электронных и стерических характеристик субстрата важ­ ное значение в создании субстратной специфичности имеет фактор суб­ стратного связывания. Он обусловлен определенной ориентацией мо­ лекулы субстрата за счет водородных связей и электростатического взаимодействия с ионными группами в составе молекулы фермента. Наряду с этим важное значение для субстратного связывания имеет так называемое гидрофобное взаимодействе между алкильными ради­ калами молекулы субстрата, с одной стороны, и гидрофобными участ­ ками молекулы фермента, образованными за счет алкильных замести­ телей в остатках таких аминокислот, как валин, лейцин и изолейцин.

Поскольку белки состоят из остатков L-аминокислот, то оптические антиподы субстрата, обладающего центрами асимметрии, образуют в процессе связывания разные диастереоизомеры. Этим обусловлена

стереоспецифичность действия ферментов.

Каталитическая активность ферментов в качестве полифункциональных катализаторов может определяться следующими группами, вхо­ дящими в остатки различных аминокислот.

427

1 . И м и д а з о л ь н а я г р у п п а о с т а т к а г и с т и д и ■ н а, обладающая основным (нуклеофильным) и кислотным центрами

испособная существовать в виде двух таутомерных форм:

—NH— СН—СО— NH—СН—СО—

Ц §гн

I

н

Эта группа может принимать участие в нуклеофильном катализе и

сн2

I

он

Сам по себе этот гидроксил характеризуется весьма низкой кислот­ ностью. Однако в сочетании с основными центрами из других остатков аминокислот, с которыми возможно образование водородных связей,

нять несколько функций. При значениях pH, близких к 7, эта амино­ группа находится в протонированной форме и обусловливает наличие катионных групп в определенных участках молекулы фермента. Кроме того, в качестве нуклеофильного центра эта аминогруппа способна к реакциям присоединения с карбонильными производными, в том числе к образованию алд- и кетаминов, амидов кислот и т. д.:

4. К а р б о к с и л ь н ы е г р у п п ы о с т а т к о в а с п а р а г и н о в о й и г л ю т а м и н о в о й к и с л о т в нейтральных раст­ ворах диссоциированы и обеспечивают наличие в молекулах фермен­ тов анионных групп, обладающих одновременно свойствами центров основности. Вследствие образования водородной связи с кислотной

428

указанные карбоксилатные группы способствуют повышению основно­ сти второго атома азота в этом цикле:

-NH— СН— СО— >,

СН2

I

щественную роль как с точки зрения образования третичной * струк­ туры молекулы фермента, так и в качестве групп, способных к кислот­ ной диссоциации. При этом образуется центр нуклеофильности на ато­ ме серы, способный к реакциям, например, с карбонильными произ­ водными:

В механизме и кинетике всех ферментативных реакций имеются некоторые общие черты. В сильно упрощенном изложении они сводятся

кследующему.

Вферментативной брутто-реакции различают стадии комплексообразования субстрата S с ферментом Е и последующее за этим соб­ ственно каталитическое превращение субстрата в конечные продукты.

На первой из этих стадий обеспечивается надлежащее с в я з ы в а ­ н и е субстрата с ферментом, подготавливающее условия для действия фермента в качестве полифункционального катализатора в одной син­ хронной или нескольких последовательных каталитических стадиях. Это отражается упрощенной схемой:

быстро

S + E ~------* SE медленн0, Е +Продукты

При небольшой концентрации субстрата равновесие образования комплекса, именуемого комплексом Михаэлиса, сдвинуто влево, кон­

* Вторичная и третичная структуры белков связаны с пространственным распо­ ложением полипептидных цепей. Закручивание в так называемуюа-спираль обуслов­ ливает появление вторичной структуры, а изгибание, переплетение и образование дополнительных связей между далеко отстоящими друг от друга участками спирали— третичной, структуры.

429

центрация fSEl пропорциональна произведению [SHE] концентраций исходных субстрата и фермента и порядок реакции как по ферменту Е, так и по субстрату S равен единице, при суммарном втором порядке. При достаточном избытке субстрата равновесие сдвинуто в сторону об­ разования комплекса Михаэлиса и почти весь фермент связан в этом комплексе. Скорость реакции достигает при этом максимально возмож­ ной для данной концентрации фермента величины, равняясь скорости дальнейшего превращения комплекса Михаэлиса. Наблюдается нуле­ вой порядок реакции относительно субстрата, дальнейшее повыше­ ние концентрации которого не влияет на скорость процесса.

Собственно каталитические стадии могут рассматриваться как со­ четание внутримолекулярного полифункционального катализа с при­ влечением некоторых дополнительных реагентов из реакционной среды, например молекул воды. В итоге комплекс Михаэлиса превращается в конечные продукты и регенерированный свободный фермент, спо­ собный к следующему каталитическому циклу. ■

Все упомянутые процессы протекают в активном центре фермента, состоящего из той или иной комбинации рассмотренных выше актив­ ных групп, а также из гидрофобных участков и ионных зарядов. В пер­ вичной структуре полипептидной цепи компоненты активного центра могут располагаться в достаточном удалении друг от друга. Их про­ странственное сближение, необходимое для образования активного центра, обеспечивается вторичной и третичной структурами молекулы фермента. Согласно представлениям некоторых авторов формированию активного центра способствует также молекула субстрата, вызывая на стадии связывания изменения в пространственной ориентации некото­ рых участков полипептидных цепей.

Потеря специфики вторичной и третичной структур называется денатурацией белка. При этом активный центр фермента «демонти­ руется», что приводит к потере каталитической активности. Денатура­ ция может быть вызвана добавкой концентрированного раствора элек­ тролита или органических растворителей, а также повышением тем­ пературы. Последнее обстоятельство обусловливает своеобразный ход температурной зависимости скорости ферментативных реакций. При умеренных температурах повышение температуры сопровождается, как обычно-, увеличением скорости. Затем достигается максимум, после чего дальнейшее повышение температуры приводит в результате про­ грессирующей денатурации фермента к падению скорости, вплоть до полного прекращения каталитической реакции.

Весьма характерной чертой ферментативного катализа является своеобразная зависимость скорости реакции от pH среды. Как уже было сказано выше, в формировании активного центра фермента могут принимать участие как основные, так и кислотные группы. Протони­ рование первых и кислотная диссоциация последних приводит к потере каталитической активности. Если основная группа характеризуется более низким значением р/Са, чем кислотная, имеется некоторый ин­ тервал pH, обеспечивающий в достаточно высокой степени необходи­ мое для катализа состояние обоих групп. При более высоких pH про­ исходит постепенная диссоциация кислотной группы, а при более низ­

430

ких — протонирование основной. И то и другое приводит к постепен­ ному уменьшению концентрации активной формы фермента и соответ­ ствующему падению скорости каталитической реакции. В результате зависимость скорости ферментативных реакций от pH имеет вид ха­ рактерной колоколоообразной кривой с максимумом, соответствующим оптимальному для данного фермента значению pH. Из количественной характеристики обеих нисходящих ветвей указанной зависимости могут быть вычислены значения рКа упомянутых основной и кислотной групп, на основании чего иногда пытаются уточнять их химическую природу.

Чрезвычайно характерной и важной особенностью ферментов яв­ ляется их инактивация под влиянием определенных ингибиторов. В ка­ честве последних часто выступают соединения, по своему строению напоминающие субстраты соответствующих ферментов*. Различают кон­ курентные и неконкурентные, обратимые и необратимые ингибиторы.

Конкурентные ингибиторы связываются в том же активном центре, что и субстраты, предотвращая взаимодействие фермента с субстратом уже на стадии связывания. При этом образуются комплексы, аналогич­ ные комплексам Михаэлиса, но не способные к дальнейшим превра­ щениям, или реагирующие очень медленно. В итоге фермент выводится из строя.

Неконкурентные игибиторы также склонны к комплексообразованию с ферментом, однако происходит это не в самом активном центре, а где-то в непосредственной его близости. Это не мешает связыванию субстрата. В то же время строение активного центра оказывается на­ столько нарушенным, что каталитическая активность либо резко по­ нижается, либо теряется совсем.

Как конкурентные, так и неконкурентные игибиторы могут быть обратимыми и необратимыми. Первые характеризуются равновесным комплексообразованием, вследствие чего при снижении концентрации ингибитора активность фермента восстанавливается. Вторые связы­ ваются с ферментом с образованием столь устойчивых комплексов,, что их диссоциация с регенерацией свободного фермента практически исключена.

Если в качестве обратимого ингибитора выступает один из продук­ тов данной ферментативной реакции, возникает обратная связь: более интенсивное протекание ферментативной реакции создает условия для понижения ее скорости. Наоборот, понижение концентрации этого ко­ нечного продукта способствует увеличению скорости его возникнове­ ния. Получается автоматическая регуляция концентрации указанного конечного продукта в неравновесной системе.

Конкретизация представлений о механизме действия каждого от­ дельного фермента . является исключительно трудной задачей. Для этого необходимо предварительное установление не только первичной, но также вторичной и третичной структур фермента. Последнее достигается обычно применением рентгеноструктурного анализа. В ито­ ге создается подробная трехмерная модель молекулы фермента. Увязы­

* Субстратами фермента называют соединения, превращения которых катализи­ руются этим ферментом.

431