Файл: Кощеев, А. К. Люминесцентный анализ пищевых продуктов.pdf

рофосфатазы и амилазы плесеней Aspergillus различны, однако при pH 4,5 оба фермента достаточноактивны.

Анализ объектов, богатых жиром, затруднен тем, что жир, переходя в бутиловые вытяжки, образует муть, ме­ шающую измерению флуоресценции. Поэтому при иссле­ довании объектов, богатых жиром, рекомендуется пред­ варительно проводить обработку проб эфиром, так как тиамин в эфире не растворим.

Приборы

Флуороскоп или флуорометры различных систем Потенциометр Термостат

Центрифуга (емкость стаканов 50—100 мл) Механическая качалка Печь тигельная

Посуда

Бюретки со стеклянными кранами на 25 и 100 мл для отмеривания метилового и изобутилового спиртов (кра­ ны бюреток не смазываются: смазка содержит флуорес­ цирующие вещества)

Микробюретка на 2 мл Мерные колбы на 50, 100 и 1 000 мл

Центрифужные стаканчики с притертыми пробками на 50 мл для окисления тиамина в тиохром (окисление можно проводить в цилиндрах и делительных воронках с притертыми пробками на 50 мл или в колбах с узким и длинным горлом на 100—200 мл)

Центрифужные стаканчики без пробок на 100 мл Делительные воронки с притертыми пробками на 50

и 100 мл Фарфоровые ступки диаметром 8—15 см

Установка для перегонки спиртов. Состоит из кругло­ донной колбы на 2—3 л, дефлегматора, холодильника Либиха и приемной колбы. Применение резиновых про­ бок не допускается.

Пробирки из нелюминесцирующего стекла (для ви­ зуальных измерений)

Адсорбционная колонка, состоящая из трех спаян­ ных концами трубок разного диаметра и длины. Верх­ няя часть колонки имеет длину 9, диаметр 2,5 см, сред­ няя— длину 15, диаметр 0,7 см; нижняя состоит из ка­

80

натрия; ОДМ раствор уксусной кислоты. Перед анализом из них изготовляют буферные растворы pH 3,8 и pH 4,5

0,1 н раствор азотнокислого серебра Раствор азотной кислоты: 1 часть воды, 1 часть азот­

ной кислоты Калий углекислый (поташ) Эфир серный

Глицерин технический Дистиллированная вода. Воду перегоняют в аппара­

те из стекла. Перегнанная в металлических кубах, ди­ стиллированная вода интенсивно флуоресцирует, вслед­ ствие чего непригодна к употреблению

Пепсин

Очищенный энзиматический препарат из плесени As­ pergillus oryzae — концентрат ряда ферментов. Пред­ ставляет собой порошок песочного цвета. Препарат изго­ товляется в энзиматической лаборатории Всесоюзного научно-исследовательского института спиртовой и лике­ ро-водочной промышленности. Энзиматический препарат из плесени. Aspergillus рекомендован для витаминологи­ ческого анализа Государственным научно-исследователь­ ским институтом витаминологии Министерства здраво­ охранения СССР. Сохраняется в течение двух лет в су­ хом темном месте в склянке с притертой пробкой.

Адсорбент катионит СДВ-3. Синтезирован в Москов­ ском химико-технологическом институте имени Д. И. Мен­ делеева профессорами И. П. Лосевым и А. С. Тевлиной. Рекомендован в качестве адсорбента тиамина витамин­ ной лабораторией Института биохимии Академии наук

СССР. Хранить его следует в склянке под слоем воды.

Определение тиамина в препаратах. Флуоресценция тиохрома измеряется в ультрафиолетовом свете со све­ тофильтром, имеющим максимум пропускания 360 /пр.

Вторичные светофильтры, установленные перед фото­ элементами и предназначенные для изоляции флуоре­ сценции тиохрома от флуоресценции различных приме­ сей, содержащихся в объектах, имеют максимум пропу­

30—50 штук драже или таблеток, определяют средний вес одной штуки. Пробу тщательно растирают в ступке,

82

Навески растворяют в воде в мерных колбах на 100 мл (растворы А\ и Л2). Из растворов готовят растворы вто­ рого разведения так, чтобы содержание тиамина в них

на 100 мл отмеривают калиброванной пипеткой 1 мл ос­ новного раствора тиамина, доводят дистиллированной водой до метки и перемешивают (рабочий раствор). 1мл раствора содержит 1 мкг тиамина.

В три стаканчика для окисления отмеривают по 1 мл рабочего раствора тиамина, добавляют по 4 мл дистил­ лированной воды и по 2 мл метилового спирта. Спирт предохраняет тиохром от вредного влияния избытка красной кровяной соли. Пробы встряхивают в течение 1 минуты. Затем в 2 стаканчика для окисления прибав­ ляют по 1,2 мл смеси красной кровяной соли и едкого натра, в 3-й стаканчик— 1 мл 30%-ного раствора едко­ го натра без феррицианида («слепая» проба). Стакан­ чики встряхивают в течение 2 минут. Из бюретки при­ бавляют 13 мл изобутилового (изоамилового, бутилово­ го) спирта и энергично встряхивают в течение 3 минут для извлечения тиохрома в спирт. Водный и спиртовой слои разделяют центрифугированием или отстаиванием в делительных воронках, при этом воронки помещают в темное место. Нижний водный слой удаляют (из центри­ фужных стаканчиков отсасывают пипеткой), в верхний спиртовой слой добавляют 2 мл этилового спирта и остав­ ляют растворы в темноте на несколько минут для просретления. После этого растворы выливают в кюветы флуорометра, кюветы помещают в темное место.

О к и с л е н и е т и а м и н а в т и о х р о м и и з м е ­ р е н и е ф л у о р е с ц е н ц и и . Из растворов драже вто­ рого разведения (Б{ и Б2) берут по 1 мл в три стаканчика для окисления. Анализ проводят так же, как при изго­ товлении эталонов стандартного раствора. После про­ светления этиловым спиртом изобутиловые вытяжки тио­ хрома выливают в кюветы флуорометра и проводят из­ мерения на аппарате. Сначала измеряют интенсивность флуоресценции стандартного эталона и «слепой» пробы к нему, затем — проб испытуемого объекта с их «слепы­ ми» пробами. Интенсивность флуоресценции отражается в отсчетах гальванометра.

Вычисление содержания тиамина производят по фор­ муле

(C -C O -ft-V -V ,

Примечание. Препараты витамина В], полученные промышленным путем, представляют из себя хлориды (тиаминхлоридгидрохлорид) или бромиды (тиаминбромидгидробромид).

При анализе препаратов на содержание витамина Bi установить природу входящего в состав тиамина галои­ да, провести качественную реакцию с азотнокислым се­ ребром. При наличии хлора выпадает белый осадок, при наличии брома — желтоватый. Драже и таблетки перед качественной реакцией озолить в присутствии углекисло­ го калия. Если качественная реакция показывает нали­ чие брома в молекуле тиамина, при расчете в числитель формулы ввести коэффициент 1,29.

84

рубку и перемешивают. Из однородной массы фарша

ную воронку, навески заливают вторично таким же ко­ личеством эфира и оставляют на 5— 10 минут. Эфирные вытяжки второй экстракции присоединяют к первой пор­ ции экстракта и добавляют по 50 мл 0,1н раствора соля­ ной кислоты. Делительные воронки встряхивают в тече­ ние 3 минут, после чего дают слоям разделиться. (Встря­ хивание эфирных вытяжек с раствором соляной кислоты проводят для того, чтобы извлечь из эфира и присоеди­ нить к навеске тиамин, который мог перейти вместе с жиром в эфир). Нижний водный слой из делительной во­ ронки (раствор соляной кислоты) присоединяют к обез­ жиренной навеске и тщательно растирают. Кашицу пе­ реводят по палочке в колбу, ступку смывают 10 мл 0,1 н раствора соляной кислоты, присоединяя жидкость к рас­ тертой в растворе соляной кислоты навеске фарша,

В дальнейшем анализ проводят по прописи, приве­ денной для объектов, бедных жиром.

М я с о и м я с н ы е и з д е л и я , б е д н ые жир о м . Если мясо тощее, то навески фарша растирают в ступке с 50 мл 0,1 н раствора соляной кислоты; содержимое пефеводят в колбу, ступку смывают 10 мл того же раство­ р а и присоединяют жидкость к кашице фарша. В колбу с кашицей тощего или обезжиренного эфиром мяса до­ бавляют 200 мг пепсина, растертого в 10 мл 0,1%-ного раствора соляной кислоты, помещают ее в термостат при температуре 45° С на 4—5 часов, при температуре 37° С — на 6—7 часов. По истечении срока инкубации со­ держимое колб нейтрализуют насыщенным раствором бикарбоната натрия до pH 3,8 — 4 (уровень pH устанав­ ливают на гидролизате одной из колб). Затем отвеши­ вают 2 навески по 50 мг энзиматического препарата Aspergillus, растирают в 7 мл ацетатной буферной смеси с pH 3,8—4, добавляют 0,5 мл толуола и ставят в термо­ стат при температуре 45°(37°) С на 12—16 часов. По ис­ течении срока инкубации гидролизаты кипятят в течение

85