Файл: Титаев А.А. Эволюция органических соединений на Земле. От углерода до биополимеров.pdf

лаву и полимер заливали горячим 1%-иым раствором хлористого натрия. Жидкость становилась слегка мутной от образовавшихся

вней в большом количестве микросфер» 181, стр. 364].

Вестественных условиях такие «термические полиаминокис­ лоты» быстро вымывались дождем с места синтеза и не успевали разрушиться 181].

Термическая полимеризация аминокислот в сухих условиях Фоксом рассматривается как единственно возможный путь син­

Фокс считает полимеризацию аминокислот в водном растворе маловероятной 181]. Но надо принять во внимание, что в предбиологических условиях не существовало чистых растворов, что в этих растворах присутствовали фсрмеитоподобные катализа­ торы и АТФ (см. ниже) и, следовательно, была возможность сни­ жения энергетического барьера, особенно благодаря присутствию адсорбентов (глин, апатита) и участию сил гетерогенного катализа.

Акабори путем применения глины удалось синтезировать «предбелок» в водном растворе. В первой стадии этого синтеза был получен аминоацетоинтрил из формальдегида. Нагревая аминоацетоннтрнл с кислой глиной до 110°, Акабори получил полпглнцин с молекулярным весом 15 ООО [149]. При взаимо­ действии полиглпцина с альдегидами и ненасыщенными угле­ водородами в молекулу его были введены боковые цепи.

Опыты Фокса и его концепция встречают ряд возражений. В самом деле, в большинстве модельных опытов, ценность кото­ рых признает и Фокс, синтез аминокислот происходил в водных растворах, которым надо было попасть на лаву и высохнуть для полимеризации по Фоксу, после чего им предстояло снова вер­ нуться в воду. Насколько вероятен этот сложный путь, сказать

на что указано Саганом [76]. Если признать, что на первобытной Земле в прибрежных зонах совмещались противоречивые условия, нужные для синтеза белка по Фоксу (высокая температура лавы и низкая температура прибрежных вод), то все же остается неле­ пым вопрос о возможности дальнейшего развития и использо­ вания протеиноидов в процессе химической эволюции и жизни первичного организма [49]. Подробные и обширные исследования свойств микросфер с помощью электронного микроскопа и других приемов позволили Фоксу назвать свои микросферы «протоклетками», поскольку в них обнаружено присутствие мембран и спо­ собность окрашиваться, подобно бактериям по Граму [81].

Спонтанный синтез белковоподобиых веществ, возможно, мог происходить в условиях, предложенных Фоксом. Никто не может

54

утверждать, что эти условия были на первобытной Земле менее вероятны, чем водные. Однако ход дальнейшей эволюции и обра­ зование протобпонта должны были происходить только в водной среде с обязательным присутствием катализаторов.

По мнению Яига, полимеризация аминокислот с образованием протеиноидов могла протекать и в первичном океане в присутствии соответствующих катализаторов одновременно с возможным па­

что на первобытной Земле в предбиологическуго эпоху могли существовать и другие системы для абиогенного синтеза белка. Наша задача состояла в подборе условий воспроизведения син­ теза полипептидной цепи из аминокислот в отсутствие ферментов и клеточных частиц при мягком температурном режиме в водном растворе [158, 159].

Подход к решению этой задтчи был найден в прпмепеппп припгипа гетерогенного катализа в присутствии АТФ. В качестве ад­ сорбента были использованы белая глина и ионообменные смолы. Работа основывалась на мысли, что в исходном растворе подбор аминокислот и их количественные соотношения должны, соответ­ ствовать составу копируемого белка.

В гервой серии экспериментов была изучена возможность моделирования синтеза простых белков — сывороточного альбу­ мина и желатины.

Методические указания. В этой работе были применены1 ионо­ обменные смолы Дауэкс 50 ( X 2, X 4, X 8, X 16) в кислотной форме, D-, L-аминокислоты и АТФ высокой степени чистоты (фирмы Реапал, Мерк и др.). Белая глина подвергалась тщатель­ ной очистке щелочью и кислотой и промыванию водой до ней­ тральной реакции.

Растворимая РНК была выделена из печени кролика и из тотальной дрожжевой РНК (венгерский препарат) [160]. Содер­ жание белка в рРНК не превышало 0,25%. Во всех других реак­ тивах белок отсутствовал.

Анализ продуктов синтеза. После инкубации системы для синтеза белка и центрифугирования адсорбент (смола, глина) элюировали растворами: 0,9% NaCl фосфатным буфером с раз­ личными значениями рН или 0,5—2 н. N H 4 0 H . Элюатьт подвер­ гали диализу, сгущали в вакууме (40°), разделяли путем электро­ фореза на бумаге в вероиаловом буфере рН 8,6 с окраской бромфеноловым синим [1611. Из параллельных неокрашенных электрофореграмм соответствующие фракции вырезали, элюировали, элюаты подвергали диализу. Для выделения высокомолекулярных продуктов из элюатов применяли также осаждение их смесью спирта и ацетона с последующим электрофоретическим разде­ лением. Молекулярный вес продуктов синтеза, очищенных элек­ трофорезом и диализом, определяли по величине осмотического давления, пользуясь осмометрами типа Булла, [162]. Очищенные

55

продукты спнтеза проверяли на отсутствие свободных аминокис­ лот хроматографией на бумаге [1'19],'подвергалигидролизу|(1—2мг вещества в 2 мл 6 п. HCI при 150° в течение 20 час) . После гидро­

группы [163], содержание белка [164], ампиоазота до и после гидролиза [165], азота по мпкрокьельдалю, пролпна и оксипролпна [166]. Разделение пептидов проводили методом высоковольт­ ного электрофореза по Мпхлъ с окраской по Ридон-Смит или Рейн- дал-Хоппе [167]. Фракции пептидов с электрофореграмм элюировали [168] 1 п. NH4 OH и после удаления N H 3 растворяли в воде, хроматографнровалп на бумаге в двух направлениях, окра­

Одномерную хроматографию проводили в смеси бутиловый спирт, ледяпая уксусная кислота, вода ( 4 : 1 : 5). При двухмер­ ной хроматографии пользовались в качестве второй смеси фенолфосфатом.

Опыты с перевариванием белка проводили с чистым трипси­ ном чехословацкой марки при рГТ 8,2 при соотношении фермента

псубстрата 1 : 12—50.

Впервой серпп экспериментов в качестве исходных растворов были применены смеси аминокислот, соответствующие составу сывороточного альбумппа человека (раствор А) и составу жела­ тины (раствор Ж).

Ход эксперимента. К 1 г адсорбепта приливали 2 мл водного раствора АТФ, затем 3 мл водного раствора 18 аминокислот в за­ данном соотпогпеппи, смесь встряхивали иа качалке в течение нескольких минут до максимума адсорбции их па смоле. Далее смесь инкубировали при 37° в течение заданного промежутка вре­ мени в присутствии нескольких капель хлороформа и толуола. В этих условиях в надежно закрытой колбочке стерильность смеси сохранялась в течение нескольких дней. По истечении срока ин­ кубации смесь обрабатывали по вышеуказанной методике.

Вторая модификация эксперимента состояла в том, что на ионообменной смоле сначала адсорбировали РНК. С этой целью к 1 г смолы приливали 10—20 мл водного раствора рРНК или тотальной (дрожжевой) РНК (0,01—0,05%) и полученную смесь встряхивали в течение различного времени. По окончании встря­ хивания жидкость удаляли, смолу с адсорбированной РНК про­ мывали дважды дистиллированной водой и после этого приливали к ней растворы аминокислот и АТФ.

Количественную сторону адсорбции различных препаратов РНК на различных сортах смолы контролировали путем измере­ ния оптической плотности раствора при 260 им на спектрофото­ метре СФ-4, принимая EJOM = 240, или путем определения со-

5G

дрожжевая РНК, полученная путем прибавления 0,05 мг 11 4 -С-

осаждением и промыванием 94%-ным спиртом, сушкой и измере­ нием удельной активности (торцовым счетчиком, фон 20 импуль­ сов). Во всех случаях были получены равноценные данные по скорости адсорбции РНК на смоле Дауэкс 50. Эти данные имели лишь вспомогательное значение и послужили для выбора сорта

протекает более плотно, чем на смоле Дауэкс 50 с меньшим числом поперечных связей ( X 2, X 4, X 8). Визуально, с помощью окраски смолы с адсорбированной РНК реактивом Ванды Мей-

лись в каждом эксперименте наряду с параллельными и контроль­

системы, состоящей из смолы Дауэкс 50, раствора 18 аминокислот, АТФ и РНК, при 37° в течение 24 и более часов можно устано­ вить образование в довольпо значительном количестве высокомо­ лекулярных продуктов синтеза, локализующихся на зернах смолы. Их присутствие в элюатах доказывалось осаждением рав­ ными объемами 10%-ной ТХУ, спирта, ацетона, или кипячением и положительной биуретовой реакцией. В растворах, отфильтро­ ванных от смолы, эти вещества содержались в концентрации, не превышающей нескольких микрограмм. Инкубация системы в те­ чение 2—6 час. не приводила к образованию высокомолекуляр­ ных веществ.

В процессе элюирования РНК оставалась в основном связан­ ной со смолой и в элюат переходило лишь небольшое количество продуктов ее деградации, устранявшееся при дальнейшей^обработке. В случае применения меченой РНК при электрофоретическом разделении элюатов фракции продуктов синтеза, окрашенные бромфеноловым'сппим, никогда метки не содержали. Фосфор АТФ в элюатах содержался лишь в следовых количествах.

Электрофоретическое исследование элюатов позволяет Гувидеть одну или более фракций продуктов синтеза, соответствующих по положению той или иной фракции сывороточных белков (рис. 4). Следует обратить внимание на то, что в отсутствие АТФ эти продукты не образуются как с РНК, так н без нее.

57

держал оксипролин (10,1%) и в высушенном состоянии был про­ зрачным, стекловидным, как и сам высушенный исходный рас­ твор.

Последующие исследования послужили для выяснения харак­ тера связи аминокислотных остатков в синтезированных про­ дуктах.

Доказательством наличия пептидных связей в них служат средние данные и пределы колебаний по содержанию N — NH 2 до и после гидролиза для семи наиболее чистых препаратов, полученных в присутствии той пли другой рРЫК, АТФ и смеси аминокислот /1:

В этом исследовании не было необходимости проводить точные

молекуле, которое в сумме составило 103 (без цистеина и трипто­ фана), а по отдельным аминокислотам распределилось следующим образом: лиз 9,57; гис 3,19; арг 5,22; асп 9,57; сер + гли 10,44; глу 12,32; тре 5,51; ала 10,58; про 5,22; вал + мет 6,52; фен 6,09;

59