Файл: Титаев А.А. Эволюция органических соединений на Земле. От углерода до биополимеров.pdf
ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 11.04.2024
Просмотров: 105
Скачиваний: 2
Имеются данные, что (3-амилаза содержит два активных центра с рН 4,3 н 7,1 с карбоксильной] и имидазолыюй (гистидии) груп пами. Молекула амилазы по своей структуре представляет со
вокупность |
трех |
полипептидных |
цепей, детали строения |
кото |
||
рых |
неизвестны. |
Этот фермент |
не содержит |
кофакторов |
[109, |
|
174]. |
Его |
синтез |
в абиогеиных |
условиях |
оказался осущест |
|
вимым. |
|
|
|
|
|
|
Ход эксперимента в его двух модификациях для синтеза амилазы был аналогичен изложенному в разделе IV . Единственное различие состояло в том, что соотношение аминокислот в инку бационном растворе соответствовало известному в литературе количественному соотношению их в природном ферменте [109]. Инкубация растворов длилась одни — пять суток при 37°, причем стерильность растворов была полностью обеспечена и сохранялась
до |
конца |
опыта. |
|
|
|
|
|
|
|
|
Отсутствие бактериального загрязнения в наших эксперимен |
||||||||
тах |
доказывается |
еще тем, что ферментная |
активность в |
филь |
|||||
тратах, где |
мог |
происходить |
рост бактерий, |
всегда |
отсутство |
||||
вала (см. табл. |
5). Она отсутствовала также в |
фильтратах |
|||||||
и элюатах |
контрольных проб, не содержавших |
АТФ, тема и т. п. |
|||||||
Отсутствием |
бактериального |
загрязнения |
объясняются |
инди |
|||||
видуальные свойства продуктов синтеза, полученных при инкуба ции аминокислотных смесей разного состава (каталаза, карбо-
ксипептпдаза |
н т. д.). |
|
Для смывания продуктов |
синтеза с адсорбента применяли |
|
0,9% NaCl, |
фосфатный буфер |
с различными значениями рН, |
раствор 0,5—2н. NH4 OH. Элюаты со смолы подвергали диализу, сгущали в вакууме (40°) или теплым воздухом. Для очистки продукта синтеза амплазного действия (именуемого далее ПАм) использовали осаждение элюатов со смолы смесью спирта и ацетона (1 : 3), адсорбцию на крахмале (в 40%-иом спирте) с последующим смыванием фосфатным буфером рН 7,2—7,4 или 0,5н. NH4 OH в присутствии СаС12 и CaS04, а затем диализом,
электрофорезом на |
бумаге. |
Для очистки продукта |
синтеза кар- |
|||||
боксипептндазного |
действия |
(ПК) к сгущенным |
элюатам |
со смо |
||||
лы добавляли NaOH до 0,1 |
и. и затем осаждали их добавле |
|||||||
нием 1 н. уксусной |
кислоты |
в присутствии |
микроколичеств |
|||||
ZnS04 . Осадок после соответствующего промывания |
взвеши |
|||||||
вали в 2 М NaCl |
и добавляли |
0,1 н. |
NaOH |
до |
растворения |
|||
осадка. |
|
|
|
|
|
|
|
|
Элюироваиные |
со смолы |
продукты |
синтеза |
каталазиого дей |
||||
ствия очистке не |
подвергались. |
|
|
|
|
|
||
Продукты синтеза подвергали структурному анализу. Опре деляли молекулярный вес, аминокислотный состав, N-концевые аминокислоты, аминоазот по вышеуказанным методам (см. раз дел 4).
Ферментативную активность ПАм измеряли в 1/15 М фосфат ном' буфере рН 7,2 по Смит и Роу [175] и по Хагедорн — Иенсен,
66
и по содержанию мальтозы хроматографией на |
бумаге. Количе |
|
ство белка |
определяли по Лоури [164].. |
' ! |
Другие |
подробности эксперимента описаны |
в предыдущей! |
разделе. |
|
|
В целях синтеза продукта, обладающего амилолитическим1 действием, была использована, как сказано выше, смесь амино
кислот, точно соответствующая |
составу амилазы слюны чело |
века или поджелудочной железы свиньи [109]. |
|
Одновременно с инкубацией |
этой смеси в качестве контроля |
в точно одинаковых условиях инкубировали с таким же адсор бентом различные другие смеси аминокислот, взятые в том же количестве: 1) смесь, соответствующую составу сывороточного альбумина; 2) смесь, соответствующую составу а-амилазы, но! не содержащую аминокислот активного центра (гистидина, серипа, глицина); 3) смесь аминокислот активного центра амилазы (в количестве 10 мг) в таком соотношении, в каком они нахо дятся в природном продукте [109].
Фильтраты, фосфатные и аммиачные элюаты со смолы во всех этих экспериментах, после удаления аммиака в строго одинако вых количественных условиях, были использованы для опреде
ления амилолитической активности по Смит |
и Роу. |
Результаты |
|||||
этих исследований представлены в |
табл. |
6, |
расчет |
активности |
|||
сделан на весь |
фильтрат |
или элюат |
с 1 г |
смолы. |
|
||
|
|
Т а б л и ц а |
6 |
|
|
|
|
Амилолнтнчеекая активность |
ээпоатов |
смолы |
|
||||
(в 1 мг крахмала, |
расщепленного |
в течение 2 час.) |
|||||
|
|
Элюаты |
|
|
Число иссле |
||
Смесь аминокислот |
|
|
|
|
|
||
|
|
|
|
|
дований |
||
|
|
фосфатные |
|
аммиачные |
|||
|
|
|
|
||||
Амилазыая |
0,022 (0-0,0S0) |
|
2,63(1,1-6,0) |
10-14 |
|||
Амилазная без |
активного |
0 |
|
0,49 (0-0,72) |
7 |
||
центра |
|
|
|
|
|
|
|
Активный центр амилазы
Альбуминовая (сывороточ ный альбумин)
—
—
0,12(0-0,6) |
7 |
1,4(0-3,5). |
5 |
II р и м е ч а и й е. В фильтратах активность не обнаружена.
Из представленных данных видно, что элюаты смолы обла дают амилолитической активностью, в фильтратах же она отсут ствует. Наибольшая активность присуща аммиачным элюатам адсорбента, инкубированного в присутствии смеси аминокислот, соответствующей составу амилазы. Активность элюатов резко уменьшается при отсутствии в смеси аминокислот активного цен-
67 |
3* |
тра амилазы или при инкубации других смесей. Активный про дукт синтеза, очевидно, локализуется на частицах адсорбента и лучше элюируется раствором аммиака, чем фосфатным буфе
ром. Адсорбент |
с адсорбированным на нем продуктом |
синтеза |
||||
обладает весьма |
слабой активностью |
(10 контрольных |
экспери |
|||
ментов). В отсутствие АТФ синтез белка |
не был ощутим. |
|||||
Характеристика |
продукта синтеза |
с |
амилазным |
действием |
||
{ПАм). |
Очищенные препараты ПАм при электрофорезе иа бумаге |
|||||
давали |
одну полосу с амилолитической |
активностью |
в |
области |
||
•у-фракции. Амилолитическую активность фракций электрофореграмм устанавливали путем инкубации их при 37° в течение 2 час. после пропитывания 0,1%-иым раствором крахмала в фос фатном буфере рН 7,2 с последующим высушиванием и окраской йодом. Для характеристики нескольких очнщениых ПАм были определены: удельная амилолитическая активность (УАА), со
держание |
белка, |
молекулярный вес, аминокислотный |
состав, |
|||
N-концевые аминокислоты, N-NH2 , |
зависимость |
активности ПАм |
||||
от рП и |
температуры. |
|
|
|
||
Как следует |
из |
данных, представленных |
ниже, удельная |
|||
амилолитическая активность (в мг крахмала па 1 мг белка) |
наших |
|||||
ПАм была ниже активности природной кристаллической |
а-ами- |
|||||
лазы в 80 и более раз. |
|
|
|
|||
|
Инкубация, |
Выход белка, % |
Удельная амшюлитн- |
|
||
|
час |
|
ческая активность |
|
||
|
48 |
|
3,74(2,05-7,70) |
17,17 (1,82—37,5) |
|
|
|
96 |
|
5,63(2,50—9,04) |
45,37 (4,2")—83,0) |
|
|
Дело в том, что наши |
препараты не могли быть получены в кри |
|||||
сталлическом виде вследствие недостаточного количественного со держания в них белка.
Два препарата ПАм были |
подвергнуты дополнительной |
очист |
ке, и их удельная активность |
увеличилась до 125,0 и 152,6. |
Моле |
кулярный |
вес наших |
препаратов, |
измеренный осмотическим |
|||
методом, |
варьировал от 8280 до 20 000 (табл. 7). |
|||||
|
|
Т а б л и ц а |
7 |
|
||
|
Молекулярный |
вес и амилолитическая |
активность |
|||
|
очищенных препаратов |
|
(на 1 мг белка) |
|||
|
Номер |
|
Молекуляр |
Удельная ак |
||
|
с |
тивность, мг |
||||
|
препарата |
|
ный вес |
крахмала на |
||
|
|
|
|
|
|
i мг белка |
|
16 |
30,0 |
|
|
8 280 |
31,250 |
|
18 |
16,0 |
|
15 530 |
61,728 |
|
|
18а |
12,7 |
|
19 530 |
17,200 |
|
|
19 |
12,3 |
|
20 000 |
6,0 |
|
68
При хроматографпческом анализе гидролизатов аминокислот ный состав синтезированного препарата оказался в значительной степени сходным но количественному содержанию с составом исходной смеси аминокислот (в %) :
Аминокислоты |
Исходный |
Синтезированный |
|
раствор |
препарат^ПАм |
||
Лизин + цнстелн |
|||
8,6 |
9,8 |
||
Гистндин + аргинин |
11,9 |
15,0 |
|
Аспарагиновая кислота |
19,3 |
16,0 |
|
Глицин + серии |
14,6 |
15,6 |
|
Треошш |
4,5 |
4,4 |
|
Глутаминовая кислота |
9,6 |
6,0 |
|
Алании + пролин |
8,6 |
8,0 |
|
Тирозин |
5,5 |
6,2 |
|
Валин, мзтиошш |
6,9 |
8,6 |
|
Фепилалашш |
|
|
|
Лейцин |
18,8 |
9,2 |
|
Изолсйции |
J |
|
Отличие в содержании аминокислот между исходным раство ром и ПАм сказалось главным образом в отношении лейцина, изолейцина, фенилаланииа, глутамииовой кислоты. В шести пре паратах ПАм были определены N-концевые аминокислоты по методу Сэиджера:
Номер препарата |
N-кбнцевые аминокислоты |
||
5-1 |
Алании, |
глутаминовая кислота |
|
5-2 |
Феннлаланнн, аспарагиновая кислота |
||
6-1 |
Глицин, |
фепилалашш, глутаминовая |
|
6-2 |
кислота |
|
|
Глицин, |
алашш, |
фепилалашш, глу |
|
14 |
таминовая кислота |
||
Глицин, |
алашш, |
лейцин |
|
18Глицин, аланшг, лейцшг
Вприродной амилазе содержатся три полипетидные цепи с N-концевыми аминокислотами — фенилаланином, аланииом и
глицином [176]. В наших препаратах |
присутствовало, |
вероят |
|||
но, от двух до четырех полипетидных |
цепей, связанных |
или не |
|||
связанных |
одна с другой. |
|
|
|
|
Доказательство полипептидной структуры ПАм можно видеть |
|||||
из данных |
по изменению |
содержания |
NH2 -rpynn после |
гидро |
|
лиза ПАм: |
|
|
|
|
|
|
Количество ПАм, мг |
|
5,65 |
|
|
|
N—ГМШ, мг |
|
|
|
|
|
первичный. |
|
0,070+0,031 |
|
|
|
после гидролиза |
0,663+0,117 |
|
||
|
увеличение, |
% |
|
10 21 |
|
69
Ниже показано изменение амилолптической удельной активности ПАм в зависимости от рЫ при 37° (опыты проводили в Vis М фосфатном буфере):
пТ-т пгш 47° |
Активность |
„ |
, ? 0 |
Активность |
||
рН при и |
П А М | % |
|
рН при |
И |
ПАм_ % |
|
|
5,0 |
1,0-1,5 |
8,8 |
|
2,2-2,5 |
|
5,6-6,6 |
1,6-2,2 |
10-12 |
|
0 |
||
6,8-7,4 |
2,2-15,0 |
|
|
|
||
Как видно, |
оптимальная |
зона |
рН для ПАм лежит в пределах |
|||
6,8-7,4. |
|
|
|
|
|
|
Удельная |
активность |
ПАм |
при постоянной рН (7,2), но при |
|||
различной температуре |
меняется значительно: при 55° остается |
||||
еще достаточно высокой, |
с повышением температуры активность |
||||
падает и при 100° |
исчезает. |
|
|
|
|
Температура, |
Активность |
Температура, |
Активность |
||
°С |
ПАм, % |
°С |
|
ПАМ, % |
|
37 |
100 |
80 |
,10 |
|
|
55 |
62 |
|
100 |
0-8,8 |
|
В целях получения белковоподобиого продукта с заданными |
|||||
ферментными свойствами |
мы использовали |
систему из адсорбен |
|||
та, АТФ и смеси аминокислот, |
точно соответствующей качествен |
||||
ному и количественному |
составу фермента — амилазы. В этих |
||||
условиях полученный продукт синтеза обладал ожидаемым амилолитпческим действием, но с пониженной активностью. По своим свойствам — отношению к нагреванию, к рН — наш препарат стоит ближе к а-, чем к (3-форме амилазы. Путем хроматографии на бумаге в продуктах гпдролиза крахмала под действием на шего препарата была обнаружена только мальтоза, глюкоза же отсутствовала. О полном соответствии нашего препарата с при
родной сс-амилазой вряд ли можно говорить, но все же |
вероятно, |
что последовательность аминокислот в нем была близка |
к после |
довательности ее в копируемом природном ферменте и конструи ровалась по закономерностям, указанным Стейиманом [148]. Активность синтезированного амилазоподобного вещества опре делялась, вероятно, констелляцией аминокислот активного цен тра, которая была близка к структуре активного центра ами лазы. Может быть, наш препарат заслуживает названия «преамилаза».
|
В е щ е с т в а с о с в о й с т в а м и |
л а к т а т д е г и д р о - |
|||||||
г е н а з ы |
и |
ф о с ф о р и л а з ы . |
|
Лактатдегидрогеназа (ЛДГ) |
|||||
катализирует |
конечную, |
обратимую, |
реакцию |
гликолиза — |
|||||
восстановление |
пировиноградной |
кислоты в |
молочную при |
||||||
участии |
никотинамиддинуклеотида |
(НАД). Этот фермент рас |
|||||||
пространен среди животных, |
где он содержится в виде L-формы, |
||||||||
а |
также |
среди |
некоторых |
бактерий |
(Lactobacillus, |
Clostridium |
|||
и |
др.), где содержится в виде L- или |
D-формы |
[109]. |
||||||
70
