Файл: Новые методы анализа аминокислот, пептидов и белков..pdf

2.2.11.Разделение стереоизомеров*

Удельное вращение плоскости поляризации света энантиоме­ рами многих биологически активных молекул часто мало; поля­ риметрические методы не всегда достаточно чувствительны, чтобы обнаружить следы изомера, сопутствующего большому избытку антипода. Такой анализ может иметь важное значение по нескольким причинам. При получении биологически актив­ ных пептидов влияние изомерных примесей кумулятивно: при­ сутствие 1% D-аминокислоты в каждой из аминокислот, вошед­ шей в 10-членный пептид, приведет к неактивному на 10% сое­ динению. Другая область, представляющая значительный инте­ рес, относится к обнаружению внеземной жизни. Уникальной особенностью макромолекул биологического происхождения яв­ ляется их способность различать и избирательно включать опре­ деленные оптические изомеры. Обнаружение преобладания одного оптического изомера на отдаленной' планете может рас­ сматриваться как указание на существование жизни [59]. Неуди­ вительно, что, несмотря на трудность разделения оптических изомеров на обычных жидких фазах, ГХ уделялось значительное внимание как быстрому способу их разделения и идентифика­ ции. Особенно успешными оказались два следующих подхода: (а) применение оптически активных жидких фаз и (б) введение в разделяемые соединения второго асимметрического центра.

2.2.11.1.Применение оптически активных жидких фаз

Первоначально этот метод был безуспешно применен к не­ скольким рацемическим смесям, не являющимися смесями ами­ нокислот [51, 73, 74], хотя в некоторых случаях достигалось очень слабое разрешение. На капиллярных колонках с лауриловым эфиром N-ТФА-изолейцина в качестве жидкой фазы [48] иссле­ дованы и частично разделены производные N-ТФА-аланина, этерифицированные четырьмя спиртами. Авторы этой работы опи­ сали почти полное разделение грег-бутилового эфира ТФА-ала- нина с циклогексиловым эфиром Ы-ТФА-ь-валил-ь-валина в качестве жидкой фазы на набивной колонке длиной, всего 2 м' [46]. Авторы полагают, что N-ТФА-грег-бутиловые эфиры других аминокислот должны разделяться на той же колонке. На капил­ лярных колонках с использованием лаурилового эфира N-ТФА-

В условиях хроматографирования не происходит рацемизации эфиров N-ТФА-аминокислот [101], поэтому указанным методом можно точно определить долю каждого изомера в смеси. Воз-

* См . т а к ж е р а зд . 3 .6 этой книги.

можные механизмы разделения рассматриваются в работах [37, 48, 120 и 135], при этом с разделением стереоизомеров связаны главным образом две последние статьи. Между разделяемыми изомерами и жидкой фазой, как полагают, существуют водород­ ные связи и, вероятно, электронные взаимодействия. В присут­ ствии оптически активной жидкой фазы из одного энантиомера непрочные диастереомеры будут образовываться несколько легче, чем из другого, и, следовательно, они будут удерживаться на колонке несколько дольше. Применение лаурилового эфира ь-изолейцина в качестве жидкой фазы показало, что изопропи­ ловые эфиры N-ТФА-ь-аминокислот удерживаются дольше со­ ответствующих D-эфиров, тогда как с лауриловым эфиром D-изолейцина наблюдается обратный порядок элюирования [48]. Функциональные группы, находящиеся в непосредственной бли­ зости от асимметрического центра, придают большие различия во временах удерживания, чем удаленные группы. Оптическую чистоту определяли также методом ЯМР в оптически активных растворителях [17, 95]. Метод ЯМР, а также метод ГХ на опти­ чески активных неподвижных фазах обладают тем преимуще­ ством, что позволяют точно определять концентрацию энантио­ меров в рацемической смеси. В любом из методов присутствие в оптически активном растворителе другого энантиомера отра­ зится на разделении, но не на определении абсолютных коли­ честв в рацемических смесях.

Если для гомологического ряда нанести логарифмы удержи­ ваемых объемов в зависимости от числа углеродных атомов, то для каждой конфигурации получится своя прямая линия [19, 37, 45, 49]. ГХ может найти применение как способ быстрого уста­ новления абсолютной конфигурации неизвестного соединения.

2.2.11.2.Диастереомеры

Более детально разработан метод введения второго асиммет­ рического центра в соединения рацемических смесей. В ряде систем наблюдалось, что при разделении l l , l d , d l и d d диастереомеров на оптически неактивных неподвижных фазах l l - и d d - соединения элюируются вместе перед l d - и DL-изомерами, кото­ рые также выходят вместе [45, 100, 127]. Это означает, что для

однозначного разделения рацемической смеси при введении вто­ рого асимметрического центра следует применять чистые энан­ тиомеры. В связи с разделением диастереомерных дипептидов на сефадексе [146] было высказано предположение о том, что в d l

соединениях предпочтительно образование циклических струк­ тур, тогда как в l l - и DD-формах существует тенденция к сохра­

нению вытянутых цепей. Диастереомеры использовались для разделения оптических изомеров путем кристаллизации еще со

4 Зак , 26

98 ГЛАВА 2

времен Пастера. С помощью этого метода недавно были полу­ чены оптически чистые спирты для этерификации аминокислот [62]. Близость двух асимметрических центров и функциональных групп способствует разделению ГХ, и вполне вероятно, что, как и для упоминавшихся выше оптически активных фаз, разделе­ ние определяется электронными эффектами и водородным свя­ зыванием между диастереомером и неактивной жидкой фазой [120, 135]. На таких полярных фазах, как карбовакс, достигается лучшее разделение, чем на неполярных [101, 135].

Ы-ТФА-о-2-бутнловые эфиры разделяли на капиллярной ко­ лонке с карбоваксом 1540 или юконом LB 550 [100]. DD-эфиры элюировались раньше LD-соединений, и этим тестом определяли рацемизацию 11 аминокислот в ходе кислотного гидролиза бычьего сывороточного альбумина. Использовавшийся для по­ лучения эфиров бутаиол-2 содержал, к сожалению, только 90% D-изомера, тем не менее эта работа намечает путь развития точ­ ного анализа рацемических смесей. Для исследования рацеми­ зации, протекающей в ходе различных методов пептидного син­ теза, применяли также метиловые эфиры N-ТФА-валилвалина [143]. Эфиры N-ТФА-аминокислот со вторичными спиртами ис­ пользовали в исследовании ряда стереоизомеров: валин и ала­ нин [19], конфигурация аминокислот в антибиотике дорицин [20]; аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, глутаминовая кислота [44]; треонин, серин, оксипролин, цистеин, аспарагиновая кислота, тирозин и триптофан (О-ацетил, где это необходимо) [99]; аланин, валин, лейцин, изолейцин, алло- изолейцин (в этой работе для метионина, оксипролина, лизина, аспарагиновой и глутаминовой кислот — соединений с дополни­ тельными функциональными центрами — были получены плохо воспроизводимые результаты) [45]; и для исследования рацеми­ зации на колонках [101]. В нескольких работах второй асиммет­ рический центр вводили с помощью дипептидов: метиловый эфир L-сс-хлоризовалериламинокислоты [58]; метиловый эфир N-ТФА-ь-пролиламинокислоты [59, 60] (получение диастереомеров) [139]; N-ТФА-валилвалин (рацемизация в ходе пептидного синтеза) [143]; все комбинации аланина, глицина, валина, лей­ цина, изолейцина, метионина и фенилаланина в виде метило­ вых эфиров N-ТФА-дипептидов [141]; Ы-ТФА-S *-пролиламиды асимметрических аминов и эфиры аминокислот [135]. Исследо­ вались также ь-ментил-И-ТФА-аминокислоты [127].

Перевод в дипептиды для введения второго асимметриче­ ского центра приводит к потере летучести, поэтому маловеро­ ятно, чтобы таким образом. можно было анализировать мало

* Относится к S — /^-номенклатуре для обозначения оптически активных соединений.

летучие аминокислоты. По этой причине, а также из-за того, что для точного определения состава рацемических смесей расщеп­ лением их на диастереомеры необходима оптическая чистота одного изомера, создается впечатление, что большее значение вскоре приобретет анализ рацемата непосредственно на оптиче­ ски активных неподвижных фазах.

2.2.12.Методы единичного, ограниченного или недавно предложенного применения

В этом разделе будут перечислены методы, не попавшие в другие разделы, потому что возможность их общего применения пока еще не доказана или не может быть доказана вообще.

Были приготовлены N-пентафторпропионил- и N-гептафтор- бутирилпроизводные для сравнения их с более привычными трифторацетильными производными. Эти производные для 14 аминокислот имели меньшие времена удерживания, чем со­ ответствующие ТФА-производные [98]. Автор рассматривает в качестве возможного преимущества для ГХ их большую лету­ честь и чувствительность к детектированию по электронному за­ хвату, хотя никаких количественных исследований он не про­ водил.

Для выяснения вопроса о присутствии цис-транс-З-окся-L- пролина в теломицине [68] М-карбобензокси-гранс-З-окси-оь- пролин был подвергнут хроматографическому анализу. Не­ сколько других изомерных производных пролина разделили в виде N-ацетил-н-бутиловых эфиров после удаления а-амино- групп остальных аминокислот в результате обработки азоти­ стой кислотой, оставляющей интактными иминогруппы изомеров пролина [92].

Реакция конденсации аминокислот с гександионом-2,5 [131] недавно предложена для использования в ГХ:

СН3

I

С

+ h 2n - r

Н2С \ с

I

СНз

Продукт конденсации этерифицируют затем раствором НС1 в метаноле. Эта реакция описана только для нескольких амино­ кислот, причем количественные данные не приводятся.

4 *

2.3.ТРИМЕТИЛСИЛИЛАМИНОКИСЛОТЫ

Замещение протона на триметилсилильную (ТМС)-группу (термин силилирование обычно используется именно в этом контексте) успешно применялось для приготовления летучих производных таких биологически важных соединений, как са­ хара [124], пуриновые и пиримидиновые основания,' нуклеозиды и нуклеотиды [42], стероиды [126], амины [63] и аминокислоты. В настоящее время имеется целый ряд реагентов и огромное число методов силилирования, причем выбор конкретных усло­ вий определяется исследуемым соединением и масштабами про­ водимой реакции. Соответствующие методы рассматриваются в появившемся недавно обзоре [94].

2.3.1.Силилирование с помощью ТМХС, ГМДС и ТМС — ДЭА *

Значительная часть работы была выполнена в основопола­ гающих исследованиях Рюльмана, изучавшего реакции транс- силилирования ТМС-аминокислот и аминов [104] и обнаружив­ шего неустойчивость ТМС-производных в водных, спиртовых и эфирных растворах. Отдельные силилированные группы в пол­ ностью силилированной аминокислоте значительно различаются по лабильности. На аминокислотах и модельных соединениях — гексановая кислота (СООН), октанол-1 (ОН) и н-октиламин (NH2) — было показано, что Si—N-связь более лабильна, чем Si—О-связь гидроксильной группы, которая, в свою очередь, ла­ бильнее связи Si—О карбоксильной группы [87]. Эти группы располагаются в обратном порядке по легкости введения ТМСгруппировок: карбоксильная группа легче всех силилируется и соответствующее производное наиболее устойчиво. При действии N-TMC-имидазола будет протекать силилирование ОН-групп, но не основных ЫНг-групп [63]. В какой степени возможно силили­ рование гуанидина, остается неизвестным, но можно думать, что эта группировка с наибольшей трудностью будет подвергаться превращению и окажется наиболее лабильной.

Можно полагать, что силилирование аминокислоты протекает в две стадии:

Этерификация карбоксильной группы происходит легче и мо­ жет осуществляться в мягких условиях с применением ГМДС

* С м . сок р ащ ен и я в р а зд . 2.6.