Файл: Новые методы анализа аминокислот, пептидов и белков..pdf
ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 14.10.2024
Просмотров: 156
Скачиваний: 0
ГАЗОВАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ ПЕПТИДОВ |
149 |
рования образующиеся метиловые эфиры N-ТФА-дипептидов ь-Glu-y-L-Ala и ь-Ala-Gly идентифицировали методом ГЖХ. Эти пептиды получались из последовательности L-Glu-y-L-Ala-Gly, доказывая таким образом первоначальную последовательность
L-Glu-y-L-Cys-Gly.
Вейганд и сотр. [17] обратились к использованию дейтерированного метанола для реакции десульфирования, чтобы с по мощью масс-спектрометрии после газохроматографического ана лиза решить, получается ли аланинсодержащий пептид из соот ветствующего цистеинсодержащего пептида. Впоследствии [7] эта методика была использована для выяснения аминокислотной последовательности в метионинсодержащем циклическом нона- г.ептиде. Пептидные фрагменты, получающиеся в результате частичного гидролиза, содержали соответственно а-аминомасля- ную (Abu) кислоту вместо метионина и после перевода в про изводные успешно идентифицировались комбинированием ГЖХ и масс-спектрометрии (см. рис. 7).
Следует упомянуть, что те же трудности встретились в ГЖХ соответствующих аминокислот с окси- и сульфгидрильными группами, которые (согласно Герке [1]) могут успешно анализи роваться с помощью ГЖХ в виде ди-ТФА-производных. Однако из-за того, что трифторацетильная группа легко отщепляется от этих группировок в присутствии влаги или даже следов спирта в растворителях, пробы нужно вводить в растворе трифторуксусного ангидрида. Для обычной работы методика кажется ме нее привлекательной, так как при повышенных температурах ангидрид будет атаковать жидкую фазу колонки.
3.3.АППАРАТУРА
3.3.1.Колонки
Вначальном периоде развития метода ГЖХ для анализа пептидов было вполне достаточно обычных колонок с высоким
содержанием набивки, так как исследователи имели дело только с метиловыми эфирами N-ТФА-дипептидов, которые до статочно летучи и позволяют проводить анализ на таких колон ках в разумное время. Однако для дипептидов с высоким моле кулярным весом приходилось мириться с очень большими временами удерживания. Все имеющиеся в литературе данные по удерживанию были рассчитаны для. таких сильно нагружен ных колонок (см. табл. 1) с изотермическим режимом. Газохро матографический анализ полного ряда пептидов, от низкомоле кулярных дипептидов и даже аминокислот до высокомолекуляр ных олигопептидов, проводится преимущественно в мало загру женных колонках с 1—5% жидкой фазы на силанизированном
Таблица 1
ОТНОСИТЕЛЬНОЕ ВРЕМЯ УДЕРЖИВАНИЯ МЕТИЛОВЫХ ЭФИРОВ N-ТФА-ДИПЕПТИДОВ НА ДИМЕТИЛСИЛИКОНПППИ ЖИДКОЙ ФАЗЕ (ОТНОСИТЕЛЬНОЕ ВРЕМЯ УДЕРЖИВАНИЯ МЕТИЛОВОГО ЭФИЯА МИРИСТИНОВОЙ^КИСЛО^Ь^Ь^О)
|
200 °С |
200 °С |
Температура |
|
|
Соединение |
210 °С |
220 °С |
225 °С |
Литера тур а
L-Al!a-L-Ala
L-AI!a-Qly
L-Al a-L-Val
L-Al a-L-Leu
L-Ala-L-Glu
L-Ala-L-Phe ‘
TMS-L-Ala-L-Tyr
Gly-L-AIa
Gly-Gly
Gly-jL-Val
Gly-]L-Leu
Gly-]>Ile
GIy-i>Glu
Gly-I.-Pro
Gly-i,-Met
Gly-i,-Phe
L-Val-L-AIa
L-Val.-Gly
L-Val-L-Val
L-Val'-L-Leu
L-Val-L-IIe
L-Val-L-Glu
L-Val-L-Met
L-Val-L-Огп r
L-Val-L-Phe
L-Leu-L-Ala
L-Leu-Gly
L-Leu-L-val
L-Leu-L-Leu
L-Leu-L-Ile
L-Leu-L-Pro L-Leu-L-Glu X-Leu-L-Met X-Leu-L-Phe X-Ile-L-Ala •L-Ile-Gly X-Ile-L-Val L-Ile-L-Leu L-Ile-L-Ile •L-Ile-L-Met -L-Ile-L-Phe •L-Pro-Gly L-Pro-L-Val L-Pro-L-Leu L-Pro-L-Phe L-Orn-L-Leu r X-Orn-L-Ala r L-Glu-a-L-Ala L-Glu-a-Gly ■L-Glu-a-L-Val •L-Glu-a-L-Leu L-Glu-a-L-Ile L-Glu-a-L-Pro L-Glu-a-L-Glu L-Glu-a-L-Phe L-Glu-y-L-Ala L-Glu-y-Gly L-Glu-y-L-Val L-Glu-y-L-Leu L-Glu-y-L-Ile
■L-GIu-y-l-GIu
L-Glu-y-L-Phe L-Phe-L-Ala L-Phe-Gly X-Phe-L-Val ■L-Phe-L-Leu X-Phe-L-Pro
[17, 23] а |
[24] 1 |
|24| б |
[24] |
[17, 23] > |
|
0,30 |
0,32 |
0,34 |
0,35 |
0,32 |
|
0,31 |
0,34 |
0,37 |
0,38 |
0,35 |
|
0,44 |
0,40 |
0,48 |
0,49 |
0,48 |
|
0,58 |
0,59 |
0,59 |
0,61 |
0,59 |
|
|
1,29 |
1.24 |
1,23 |
1,95 |
|
|
2.08 |
|
1.93 |
||
0,35 |
0,37 |
0,38 |
0,41 |
5,4 |
|
0,38 |
|||||
0.39 |
0,39 |
0,41 |
0,43 |
0,41 |
|
0,53 |
0,53 |
0,55 |
0,56 |
0,56 |
|
0,70 |
0,69 |
0.70 |
0.69 |
0.70 |
|
0,71 |
|
|
|
0,7! |
|
1,68 |
1,57 |
1,51 |
1,47 |
||
1,51 |
|||||
|
1.75 |
1,67 |
1,64 |
0,99 |
|
|
2,37 |
||||
2,66 |
2,51 |
2,42 |
2,28 |
||
0,42 |
0.43 |
0,45 |
0,47 |
0,46 |
|
0,46 |
0,46 |
0,49 |
0,50 |
0,49 |
|
0,64 |
0,62 |
0,63 |
0,66 |
0,66 |
|
0,83 |
0,77 |
0,79 |
0,80 |
0,82 |
|
0.84 |
0,82 |
0,82 |
0,82 |
0,83 |
|
2,03 |
1.75 |
1,63 |
1,62 |
1,90 |
|
2,68 |
2,48 |
2,38 |
|||
|
|||||
2,95 |
2,60 |
||||
2.84 |
2,70 |
2,58 |
|||
0,54 |
0,53 |
0,55 |
0.55 |
0,55 |
|
0,58 |
0,58 |
0,60 |
0,61 |
0,61 |
|
0,77 |
0,76 |
0,78 |
0,78 |
0,78 |
|
1,01 |
0,96 |
0,95 |
0,96 |
0,98 |
|
1,04 |
|
— |
— |
1.01 |
|
1,23 д |
— |
1,19 |
|||
_ |
2,15 |
2.06 |
1,97 |
— |
|
2,60 |
— |
— |
— |
2,35 |
|
3,48 |
3,48 |
3,23 |
3,11 |
3,14 |
|
0,56 |
0.56 |
0,58 |
0,61 |
0,59 |
|
_ |
0,62 |
0,64 |
0,66 |
— |
|
0,83 |
0,81 |
0,80 |
0,84 |
0,83 |
|
1.07 |
1,01 |
1,01 |
1,01 |
1,04 |
|
1.15 |
1,07 |
1,05 |
1,05 |
1,06 |
|
2.79 |
— |
— |
— |
2,45 |
|
_ |
3,65 |
3,45 |
3,23 |
— |
|
0,74 |
0.76 |
0,77 |
0,88 |
||
_ |
1.13 |
1,13 |
1,15 |
— |
|
_ |
1,37 |
1.34 |
1,33 |
1.35 |
|
_ |
— |
4,94 |
4,60 |
— |
|
_ |
2,88 |
2,70 |
2,56 |
— |
|
_ |
1.68 |
1.60 |
1,55 |
— |
|
1,14 |
1.14 |
1,12 |
1,10 |
1,10 |
|
_ |
1.26 |
1.23 |
1,23 |
1,20 |
|
1,61 |
1,55 |
1.51 |
1,50 |
||
2,13 |
1,01 |
1,91 |
1,86 |
1,88 |
|
2,25 |
— |
— |
— |
1,97 |
|
— |
2,65 |
2,42 |
2,36 |
— |
|
_ |
4,68 |
4,15 |
3,96 |
— |
|
_ |
7,43 |
6,52 |
6,20 |
6,27 |
|
|
___ |
1,51 |
1,50 |
1,48 |
|
_ |
— |
|
— |
1.58 |
|
|
|
|
|||
— |
2,21 |
2.11 |
— |
||
3,20 |
— |
2,76 |
2,62 |
2,68 |
|
3,23 |
— |
— |
— |
2.75 |
|
_ |
— |
6.05 |
5,46 |
— |
|
— |
9.95 |
8,70 |
8,78 |
||
1,97 |
— |
— |
— |
1,83 |
|
2,14 |
2,06 |
2,00 |
1,92 |
1,96 |
|
___ |
2,73 |
2,61 |
2,48 |
— |
|
|
|
|
|||
3,66 |
3,39 |
3,22 ' |
3,01 |
3,11 |
|
— |
3,86 |
3,66 |
3,53 |
|
|
О |
Соединение |
Ю © о О |
|
|
|
[17. 23) а |
iL-Phe-L-Glu |
_ |
i-Phe-L-Met |
— |
i-Phe-L-Phe |
— |
|
190 °С |
|
[171 а |
TMS-L-Ser-L-Ala |
0.64 |
TMS-L-Ser-L-Val |
0,97 |
TMS-L-Ser-L-Leu |
1.22 |
TMS-L-Ser-L-Ile |
1.33 |
TMS-L-Ser-L-Pro |
1.58 |
TMS-L-Ser-L-Met |
— |
TMS-L-Ser-L-Phe |
4.47 |
TMS-L-Thr-L-Ala |
0,60 |
TMS-L-Thr-L-Val |
0,93 |
TMS-L-Thr-L-Leu |
1.15 |
TMS-L-Thr-L-IIe |
1.25 |
TMS-L-Thr-L-Pro |
1.61 |
TMS-L-Thr-L-Met |
— |
TMS-L-Thr-L-Phe |
— |
аВычислено из приведенного времени удерживания,
бВычислено из полного времени удерживания.
в TMS —триметилсилильиые производные. г дн-1^-ТФА-пронзводные.
л Значения при 204 °С (10].
200°С
[24]6
7,80
—
12.3
201°С
117)а
0,65
0,97
1.19
1,28
1.53
3.10
4.08
0.61 д
0.92
1.11
1,23
1.55
2,88
4,10
Температура
О о © 40
Литература
[24| б
6,70
—
10,9
Температура
210 °С
Литература
П71 а
0,65
0.95
1,17
1,26
1.49
2,94
3,82
0.63
0.92
1,10
1.20 д
1,53
2,74
3,86
Продолясение табл, 1
220 °С |
225 °С |
|
[24] 6 |
[17, 231 а |
|
6,45 |
— |
|
7,25 |
||
— |
||
9,8 |
9,9 |
|
222 °С |
|
|
(171 а |
|
|
0,66 |
_ |
0,95 |
— |
|
1,14 |
— |
|
1,23 |
||
— |
||
1,46 |
||
___ |
||
2,72 |
||
— |
||
|
——
0,65 |
— |
|
0,92 |
— |
|
1,09 |
___ |
|
1,17 |
||
___ |
||
1.50 |
— |
|
2,49 |
||
— |
||
3,56 |
||
— |
ГАЗОВАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ ПЕПТИДОВ |
153 |
носителе и с программированием температуры, как это представ лено на рисунках. Из-за высоких температур можно применять только жидкие фазы, обладающие хорошей термической устой чивостью. Примерами таких фаз служат различные диметилсиликоновые полимеры SE-30, OV-1 и OV-101, или метилфенилсиликоны SE-52 и OV-17, имеющие более полярный характер. Не давно был получен большой ряд пригодных для высокотемпера турного применения силиконовых полимеров, имеющих исклю чительную термическую стабильность и высокую полярность;' все эти материалы представляют интерес для возможного при менения в пептидах. Кроме различных силиконовых жидких фаз, использовались также набивные колонки с апиезоновой смазкой [17]. Набивная колонка с 0,5% FFAP на хромосорбе-W служила для специального разделения двух диастереомерных метиловых эфиров N-ТФА-трипептидов [19]. Колонка с 15% по лиэфирной жидкой фазы использовалась для разделения ТМС-производных метиловых эфиров N-TFA-L-Ser-L-Ala и N-TFA-L-Thr-L-Ala. На неполярной силиконовой колонке это разделение не могло быть достигнуто, но на полиэфирной ко лонке фактор разделения равнялся 1,9*, при этом большее время удерживания имело соединение с серином. До настоящего времени в анализе пептидов использовалась такая колонка с высоким содержанием полиэфира, и, возможно именно из-за длительных времен удерживания, больше не появлялось публи каций по ее применению. Напротив, колонки с низким содержа нием полиэфиров представляют интерес для анализа пептидов, так как оказались очень полезными в анализе аминокислот.
Капиллярные колонки до сих пор применялись изотермически только для некоторых специальных случаев — главным образом при сложном разделении изомеров [6, 18, 20, 22]. С обычными капиллярами из нержавеющей стали наблюдались хвосты и асимметричные пики, что снижало эффективность этих колонок. Применяя стеклянные капилляры, можно устранить трудности и получить острые симметричные пики (см. рис. 1, 2 и 4). Стек лянные капилляры для этих хроматограмм были приготовлены согласно разработанной Гробом методике [21] покрытия стек лянной поверхности слоем сажи перед нанесением жидкой фазы. Методика оказалась чрезвычайно удачной для получения свя занной пленки жидкой фазы, в особенности при использовании полярных жидких фаз.
Помимо одного случая применения силикона SF-96, в каче стве жидкой фазы [18] в капиллярах использовались полипропиленгликоль или полифениловый эфир OS-138, причем эти жидкие фазы умеренной полярности оказались особенно цен
* Частное времен удерживания,