Файл: Новые методы анализа аминокислот, пептидов и белков..pdf

состоит в том, что они являются неспецифическими и поэтому могут затруднять идентификацию интересующих компонентов.

Усовершенствуют классические детекторы для нингидриновой реакции путем создания непульсирующего потока жидкости, уменьшения образования пузырьков газа и улучшения фотоэле­ ментов.

Андерсон с сотр. [126] описал хроматографическую систему с регулированием давления и с клапаном обратного давления после кювет детектора. Основываясь на усовершенствовании хроматографической системы, он предвидит возможность умень­ шения размеров и веса анализаторов аминокислот, улучшения хроматографического разделения за счет уменьшения переме­ шивания в реакторе, а также уменьшения соотношения величин шум — сигнал, что позволит усиливать сигнал. Авторы предпо­ лагают, что размеры жидкостных хроматографов будут умень­ шены с 2,7 до 0,014 м3 без потери точности или увеличения про­ должительности анализа.

1.2.7.Контроль температуры колонки

Кинетика обмена в ионообменной хроматографии амино­ кислот и пептидов сильно зависит от температуры. Воспроиз­ водимый контроль температуры колонки требуется для того, чтобы получить воспроизводимые последовательность и время выхода пиков, необходимые для идентификации аминокислот или пептидов и для разделения близких по свойствам соедине­ ний. Эти контролируемые условия обычно достигаются путем циркулирования воды из термостата по рубашке колонки. Тер­ мостат снабжается контрольным термометром. Емкость термо­ стата, мощность нагрева и скорость подачи воды насосом дол­ жны быть достаточными для поддержания температуры в рубашке колонки с точностью ±0,5 °С в диапазоне 30—70 °С. Од­ ной из тонкостей программирования температуры является ско­ рость повышения температуры при переходе от одной темпера­ туры к другой, как это предписывается многими методиками анализа. В тех случаях, когда по методике для данного прибора требуется смена температуры, которая происходит в течение 20 мин, любой другой температурный градиент может привести к нежелательным результатам. Поэтому неудивительно, что не­ которые методики не удается воспроизвести на сходных прибо­ рах, если режимы изменения температур не одинаковы. Целесо­ образно включать градиентное термостатирование в основную конструкцию анализатора.

1.2.8.Автоматизация

Автоматические анализаторы аминокислот относятся обычно к типу, который был разработан Опэкманом, Муром и Стейном

в 1958 г. Эти анализаторы автоматизированы, а определенные функции прибора, необходимые для выполнения анализа, про­ граммируются. По старым методикам для полного анализа кис­ лых, нейтральных и основных аминокислот требовалось более одного рабочего дня. В ходе анализа использовалась автомати­ ческая система для переключения буферов и изменения темпе­ ратуры колонки. Кроме того, существенно, чтобы нингидриновый реагент вымывался из реактора в конце анализа. При оконча­ нии анализа сначала автоматически выключаются нингидринный насос и самописец, а затем по заранее установленному времени выключается буферный насос. В течение этого времени работы буферного насоса из реактора удаляется нингидриновый реа­ гент.

При современных скоростных методах анализа аминокислот и большом числе проб, в которых нуждаются многие исследова­ тели, для сокращения времени, затрачиваемого на ввод пробы и расчет результатов анализа, необходима автоматизация или по крайней мере упрощение некоторых из этих операций. Гиб­ кость хроматографических систем допускает различную автома­ тизацию. По некоторым методикам анализ проводят при одной температуре и с использованием только одного буфера; в этом случае анализ может быть завершен за 18 мин (например, ана­ лиз тирозина и фенилаланина; см. разд. 1.6.7). Для таких ана­ лизов многие автоматические операции не требуются; однако для облегчения работы удобно иметь автоматический ввод проб.

. Устройства для ввода проб должны обеспечивать количест­ венный перенос пробы в колонку, предотвращать попадание воз­ духа или газов, вводить пробу без искажения формы пиков. Автоматический метод ввода проб должен быть надежным, гарантированным от потерь проб.

В настоящее время имеется два типа устройств для ввода проб, которые удовлетворяют этим требованиям: в одних исполь­ зуются калиброванные капиллярные трубки, в других — малень­ кие патроны или колонки со смолой. Несмотря на то что оба типа устройств пригодны для гидролизатов и физиологических жидкостей, первый тип наиболее пригоден для белковых или пептидных гидролизатов, поскольку они обычно не содержат коллоидных примесей, которые могут быть вредными для смолы (например, липиды, клетки и т. п.). С другой стороны, второй тип наиболее пригоден для анализа свободных аминокислот физиологических жидкостей, например плазмы. Колонки со смо­ лой в этом типе устройства для ввода проб сорбируют амино­ кислоты, которые должны быть проанализированы, и служат в качестве фильтра для удаления обнаруживаемых в пробе при­ месей. Элюирующий буфер, который затем переносит пробу в

32 ГЛАВА I

хроматографическую колонку, вымывает и сорбированные ами­ нокислоты из возможных белковых коллоидов.

Введение пробы уменьшает также свободное пространство колонки (объем жидкости над смолой). Для устранения свобод­ ного пространства в настоящее время используется простой ре­ гулируемый адаптер винтового типа. Для этих же целей разра­ ботан автоматический адаптер, предотвращающий разбавление пробы и позволяющий осуществлять регулировку при любом слабом сжатии или расширении столбика смолы.

Другие аспекты хроматографического анализа, связанные с автоматизацией, включают разработку техники подсчета пло­ щади пика и перевода выходных данных самописца в форму, которая позволяла бы соотносить концентрацию определенного

пика с концентрацией в пробе.

Интенсивность окраски реакционной смеси, получающейся при добавлении нингидринового реагента к эффлюенту, изме­ ряется проточным колориметром в условиях постоянной ско­ рости потока жидкости. Возникающее изменение напряжения на фотоэлементе регистрируется самописцем. Обычно выходное на­ пряжение колориметра на самописец составляет 0—5 мВ. При максимальном развитии окраски (наивысшая оптическая плот­ ность, ОП) напряжение равно нулю, а при отсутствии, за исклю­ чением фона реагентов (фоновая линия), напряжение состав­ ляет 5 мВ. Для точной записи результатов хроматографического анализа самописец должен: а) точно реагировать только на сигнал фотоэлемента калориметра; б) допускать длительную работу с минимальным дрейфом из-за тепловых и электрических помех; в) иметь постоянную скорость лентопротяжного меха­ низма для обеспечения точной идентификации пиков по времени. Если запись на самописце производится на диаграммной бумаге с линейной шкалой, то для расчета пиков аминокислот или пеп­ тидов необходим шаблон с нанесенной сеткой ОП. Если само­ писец снабжен диаграммной бумагой со шкалой в единицах ОП или логарифмической шкалой, величина поглощения находится непосредственно. Другими вспомогательными элементами, кото­ рые связаны с записью анализа и считаются составными частя­ ми системы регистрации, являются устройства, осуществляющие расширение шкалы, логарифмирование сигнала, интегрирование пика, а также цифропечать и связь с ЭВМ. Расширение шкалы представляет собой метод, по которому вся шкала самописца может быть легко заменена с 0—5,0 мВ на 4,0—5,0 или 4,5— 5,0 мВ. Таким способом можно зарегистрировать низкую кон­ центрацию аминокислот и рассчитать их количество. Логариф­ мирование сигналов в единицах ОП осуществляется электронной схемой. Эта операция устраняет использование диаграммной бумаги в единицах ОП или шаблона с единицами ОП для руч-