Файл: Новые методы анализа аминокислот, пептидов и белков..pdf

Вторая, «сигнальная», группировка служит для передачи инфор­ мации о своем непосредственном окружении. Эта информация может быть представлена в виде спектральных смещений, изме­ нения окраски, флуоресценции или же в виде сигналов ЭПР.

9.6.1.Спектральные смещения полос поглощения остатков ароматических аминокислот

Полосы поглощения в УФ-области остатков триптофана, ти­ розина и фенилаланина сами по себе могут дать информацию относительно их непосредственного окружения. В зависимости от окружения может наблюдаться смещение максимума полос по­ глощения или изменение интенсивности. Ветлауфер и сотр. [256], а также Донован [257] и сотр. исследовали влияние заряда вслед­ ствие ионизации карбоксила, протонирования аминогруппы или других факторов на УФ-спектры ароматических аминокислот. Бигелов с сотр. [258, 259] изучали влияние растворителей и со­ става раствора.

Остаток ароматической аминокислоты может быть доступен для растворителя и подвергаться воздействию среды, или он мо­ жет быть маскирован в глубине глобулы, т. е. окружен боковыми цепями других аминокислот. В зависимости от состава среды или природы соседних аминокислот в УФ-спектре могут наблюдаться те или иные изменения, которые измеряют с помощью дифферен­ циальной спектрофотометрии между нативным и денатурирован­ ным или гидролизованным белком или же снятием спектров в различных средах. Например, по данным Инада [10], в диффе­ ренциальном спектре остатков триптофана в пепсине максимум лежит в области 298 нм, а Аб = 365 Мг1 см-1, по данным Доно­ вана [257], Ае = 240 М-1 см-1. Если построить график поглоще­ ния растворов пепсина при 298 нм в зависимости от pH, то на кривой будут видны две стадии изменения состояния 6 остатков триптофана [10, 260, 261]: п = 2 с рК 4,0 и п = 4 с рК 7,2 (про­ дукт необратимой денатурации). Две стадии наблюдаются в из­ менении поглощения для 2 из 6 остатков триптофана в лизоциме:

п = 1 с рК 3,15 (Де = 375 Мг1 см-1) и п = 1 с рК 6,2 (As =

=438 М '1 см"1).

Если спектр остатков данного вида претерпевает изменение

при добавлении химического реагента или иного растворителя, то можно определить число доступных остатков [262]. Интерес­ ные наблюдения получены Хамагучи [263, 264] при добавлении к лизоциму таких денатурирующих агентов, как гуанидин, моче­ вина и хлористый литий. Например, при увеличении концентра­ ции гуанидина можно наблюдать три стадии в изменении погло­ щения: 1) спектральные изменения (за счет добавления гуаниди­ на) остатков триптофана (я = 3— 4), доступных и подвержен­ ных действию растворителя; 2) изменения поглощения остатков

триптофана, демаскированных вследствие денатурирующего дей­ ствия гуанидина; 3) спектральные изменения за счет воздействия гуанидина на все демаскированные остатки триптофана. Для по­ добного рода исследований используют также тепловую денату­ рацию [265]. Аналогичные спектральные изменения наблюдаются для двух остатков триптофана в химотрипсине после обработки фермента ДФФ [266—269] или при активации химотрипсиногена [270, 271]. Изменения в спектре поглощения тирозина с трудом поддаются анализу вследствие перекрывания с полосами трипто­ фана. Было показано, что в инсулине, не содержащем трипто­ фана, спектральные изменения наблюдаются для одного остатка тирозина (/г( = 4) при протеолизе белка, а для второго — при подкислении гидролизата [22—23].

9.6.2.«Репортерная» группа

При алкилировании белка 2-бромацетамидо-4-нитрофенолом или 4-бромацетамидо-З-нитрофенолом получают окрашенное в желтый цвет производное с так называемой «репортерной» груп­ пой, спектр которой зависит от ее непосредственного окружения [272, 273]. В случае триозофосфатдегидрогеназы — белка, со­ стоящего из 4 субъединиц, каждая из которых имеет НАД-свя- зывающий участок и активную SH-rpynny — 1 моль фермента связывает 3,7 моля 2-бромацетамидо-4-нитрофенола. В районе pH 7,0—7,6 е соответствующей группировки в белке составляет 7100 М-1 см-1 (при Ящах = 390 нм). Алкилирование ведет к по­ тере 3,8 моля SH-групп и полной инактивации фермента.

Если из раствора модифицированного белка сорбцией на угле удалить НАД, а затем прибавить вновь, то полоса поглощения репортерной группы (390 нм) смещается в длинноволновую об­ ласть. В дифференциальном спектре при таком смещении обна­ руживается максимум при 420 нм и минимум при 370 нм. Алки­ лирование дегидрогеназы 4-бромацетамидо-З-нитрофенолом протекает примерно с таким же выходом (4,1 моля), а полоса репортерной группы 426 нм смещается в область 436 нм (при 435 нм и pH 6,9 е = 3000 М-1 см-1) [274]. Однако при добавлении НАД эта полоса смещается в коротковолновую область спектра. Эти же реагенты способны алкилировать остаток метионина в химотрипсине; при добавлении бензоилфенилаланина к модифи­ цированному ферменту полосы этих двух группировок также смещаются в противоположных направлениях. Репортерная группа ТНМ обладает аналогичными свойствами [49].

9.6.3.Метод спиновой метки

Реагенты для введения спиновой метки, впервые предложен­ ные Ониши и МакКоннелом [275], содержат радикалы, спектр ЭПР которых чувствителен к окружению метки. В области химии

белка нашли применение хлорпромазин и N-окиси; особенно ши­ рокое применение нашли более стабильные N-окиси типа

Н R

где R означает реакционноспособную группировку. В сочетании с Si и S2 использовали несколько реакционноспособных группи­ ровок, предназначенных для модификации боковых цепей раз­ личных аминокислот.

Реагент Si—Re применяли для модификации бычьего сывороточ­ ного альбумина. По данным спектроскопии ЭПР радикалы Si, фиксированные на белке, находятся в двух различных состоя-, ниях: в состоянии свободного вращения и в неподвижном или заторможенном состоянии. Более устойчивый реагент Si—R& ис­ пользовали для модификации 15 различных белков и ферментов. Показано, что в креатинкиназе и гемоглобине радикал Si, фикси­ рованный при SH-группе, находится в неподвижном состоянии. Радикалы, фиксированные на других белках и на полилизине, находятся в состоянии свободного вращения. При исследовании гемоглобина использовали реагенты Si—Rj,, Si—Rc, Sr—Rd и

378 ГЛАВА 9

S2—Rb [278—280, 282]. Спектр ЭПР меченого оксигемоглобина представлял собой наложение широких и узких полос, вызванных радикалами, фиксированными в (3-субъединице при SH-rpynne Cys93 и по остаткам лизина. При сравнении этого спектра со спектром дезоксигемоглобина обнаруживается некоторая затор­ моженность радикалов первого типа, вызванная оксигенированием. При образовании тетрамера агРг после смешения меченой р-субъединицы с а-субъединицей спектр ЭПР претерпевает оп­ ределенные изменения.

Иные задачи решались при исследовании взаимодействия ре­ агента Si—Re с химотрипсином [281]. Этот реагент типа А—О—S сорбируется на участке связывания химотрипсина через арома­ тическую группу Re; спектр ЭПР свидетельствует о полной затор­ моженности радикала Si.

9.6.4.Связывание флуоресцентных меток

сгидрофобными участками белковой глобулы

Присутствие гидрофобных областей в структуре белков дока­ зано экспериментально по данным растворимости углеводородов в растворах белков [283—286] и по интенсификации флуоресцен­ ции реагентов типа R—О—S или А—О—S, связанных или сорби­ рованных в этих областях. На большое значение флуоресценции при таких исследованиях впервые указывали Остер и Нишиджима [287, 288]. Они подчеркивали, что молекула основания со свободно вращающейся группой хромофора начинает сильно флуоресцировать, если вращение заторможено вследствие ад­ сорбции. Тушение флуоресценции вследствие теплого рассеяния энергии возбуждения за счет внутреннего вращения может быть уменьшено при фиксации планарной молекулы на биополимере. В последнее время подобное увеличение флуоресценции иссле­ дуется в связи с наличием в белках гидрофобных областей. На­ пример, при адсорбции 1-анилино-8-нафталинсульфокислоты (АНС) на апомиоглобине и апогемоглобине, свободных от груп­ пы гема, флуоресценция группы претерпевает изменения; добав­ ление гема восстанавливает первоначальную флуоресценцию [289]. При адсорбции полоса флуоресценции 515 нм смещается в область 454 нм, а квантовый выход увеличивается в 200 раз, от 0,004 до 0,98. Вообще я я возбужденные состояния я-электрон- ной системы стабилизуются по сравнению с основным состоянием за счет воздействия молекул растворителя в относительно боль­ шей степени, так что снятие этого эффекта интенсифицирует флуоресценцию и вызывает смещение в длинноволновую часть спектра. Опыты с модельными соединениями в растворителях с различными дипольными моментами свидетельствуют в пользу такого объяснения. Доказательством наличия в бычьем сыворо­