Файл: Новые методы анализа аминокислот, пептидов и белков..pdf

Нативная конформация (если иметь в виду четвертичную структуру) может поддерживаться еще и ионами металлов и простетическими группами.

Ассоциация отдельных полипептидных цепей друг с другом обусловлена теми же связями, которые определяют и стабилизи­ руют вторичную и третичную структуры. Четвертичная структура является только одним из типов структуры белка, и ее нельзя рассматривать отдельно от других типов, особенно при анализе взаимодействия белок — растворитель. Следовательно, при выяс­ нении вопроса о четвертичной структуре не следует упорно ис­ кать ответ на вопрос, какая же из всех возможных связей яв­ ляется наиболее важной при объединении полипептидных цепей в нативную белковую молекулу. Ее создание является коопера­ тивным процессом, в котором участвуют все упомянутые ранее связи.

10.1.4.Универсальное проявление

Молекулярные веса различных белков покрывают широкий диапазон от нескольких сотен до нескольких миллионов. Если белки имеют молекулярные веса свыше 100 000, они, как пра­ вило, являются комплексами нескольких полипептидных цепей. Молекулярные веса отдельных полипептидных цепей обычно не превышают 50 000. В табл. 1 приведены некоторые характери­ стики белков, имеющих четвертичную структуру.

Полимераза дезоксирибонуклеиновой кислоты Е. coli имеет молекулярный вес 109 000 и состоит, вероятно, только из одной полипептидной цепи [59]. Это заключение основано на следующих фактах: а) наблюдается отсутствие изменения молекулярного веса после разворачивания полипептидной цепи в растворе 6М гуанидингидрохлорида с 0,ЗМ р-меркаптоэтанолом; б) обнару­ жен только один N-концевой остаток метионина; в) в присут­ ствии денатурирующих агентов обнаружена только одна зона при электрофорезе в полиакриламидном геле. Насколько нам известно, еще не найден какой-либо другой фермент или белок, имеющий одну-единственную полипептидную цепь с молекуляр­ ным весом выше 100 000. Однако молекулы ферментов, состоя­ щие из нескольких полипептидных цепей более высокого молеку­ лярного веса, все же существуют (например, р-галактозидаза Е. coli и миозин [60]).

Наличие четвертичной структуры — общая структурная черта белков, поскольку она обнаружена у многих типов белков [4]: у ферментов и низко- и высокомолекулярных белков респиратор­ ной цепи, у глобулинов семян растений, у сывороточных белков и белков типа коллагена или белков флагелл бактерий, т. е. структурных белков, а также у белков вирусов, полиферментных комплексов и рибосом.

Весьма вероятно, что генетический феномен межаллельной комплементарное™ может быть объяснен на основе понятий чет­ вертичной структуры, и поэтому он не встречается у ферментов, состоящих из единственной полипептидной цепи [61, 62]. Такое же объяснение применимо и к проблеме изоферментов [4]. На­ сколько известно, феномен аллостерии [17] характерен только для белков, построенных более чем из одной полипептидной цепи.

Принцип четвертичной структуры допускает синтез белковых молекул с высоким молекулярным весом на основе относительно небольшого объема генетической информации, достаточного для того, чтобы комплексы, образуемые ассоциацией, были биологи­ чески активными. Этот принцип экономии [4] особенно очевиден для крупных, упорядоченных биологических структур, как, на­ пример, оболочек вирусных частиц или структурных белков, ко­ торые состоят либо из идентичных полипептидных цепей, либо из небольшого числа полипептидных цепей разного типа. Например, белковая оболочка вируса табачной мозаики имеет молекуляр­ ный вес 37-106 и состоит из 2130 идентичных полипептидных цепей.

10.2.ИЗУЧЕНИЕ ЧЕТВЕРТИЧНОЙ СТРУКТУРЫ

Для изучения четвертичной структуры белковых молекул ис­ пользуется ряд методов. Широко распространены те из них, ко­ торые способны фиксировать тот факт, что в присутствии денату­ рирующих агентов компактные глобулярные белковые молекулы разворачиваются и диссоциируют на полипептидные цепи. При­ влекаются также методы ограниченного применения, которые не дают прямого ответа и используются только в особых случаях.

10.2.1.Рентгеноструктурный анализ [63]

По данным рентгеноструктурного анализа даже при относи­ тельно низком разрешении может быть выявлено взаимное рас­ положение и общее очертание отдельных субъединиц или поли­ пептидных цепей (например, были анализированы гемоглобин [16, 35], аспартаттранскарбамилаза [58],' алкогольдегидрогеназа печени лошади [39], лактатдегидрогеназа акулы [44], вирус табач­ ной мозаики [64]). Однако этот метод очень сложен и дорог и не может использоваться в обычной аналитической практике.

10.2.2.Электронная микроскопия [65—68]

Расположение субъединиц или полипептидных цепей — мор­ фологию— можно наблюдать непосредственно с помощью элек­ тронного микроскопа, особенно при использовании техники отри­ цательного контрастирования. Примерами этого могут служить

\М 45 000), которые обнаруживаются в присутствии 1% натрийдодедилсульфата.

Глутаматдегидрогеназа находится в состоянии равновесия ассоциации — диссоциации с субъединицами, обладающими фер­ ментативной активностью; молекулярный вес минимальной по массе ферментативно активной субъединицы равен 310 000 [9, 10]. Из результатов измерения вязкости и рассеяния рентгеновских лучей под малыми углами следовало, что молекула этого фер­ мента имеет удлиненную форму в ассоциированном состоянии, а при диссоциации происходит ее поперечное расщепление [8]. Данные электронной микроскопии (рис. 5) подтвердили это за­ ключение. Субъединицы с М 310 000 состоят из полипептидных цепей (М 50 000—60 000), обнаруживаемых в условиях денату­ рации.

Пространственное расположение белковых субъединиц в ви­ русах, особенно в сферических, полученное на основе исследова­ ния дифракции рентгеновских лучей и электронной микроскопии, описано в работе [72].

10.2.3.Анализ концевых групп [25, 73—75]

Анализ концевых групп является классическим методом хи­ мии белков, в котором N- и С-концевые аминокислоты каждой полипептидной цепи определяются с помощью специфических ре­ агентов или ферментативным гидролизом. Во многих случаях бывает трудно рассчитать число полипептидных цепей на основе анализа концевых групп только потому, что выход концевой ами­ нокислоты после ферментативного гидролиза или химической ре­ акции иногда оказывается очень низким. Другая трудность при идентификации полипептидных цепей с помощью анализа конце­ вых групп заключается в том, что аминогруппа N-концевой ами­ нокислоты может быть заблокирована ацетильной группой.

10.2.4.Анализ пептидных карт [25, 73, 75—77]

Методика получения пептидных карт или «отпечатков паль­ цев» очень полезна при определении идентичности полипептид­ ных цепей. Согласно этой методике, белок обрабатывают трип­ сином, который избирательно гидролизует пептидные связи, об­ разованные карбоксильными группами основных аминокислот, аргинина и лизина. Образующаяся смесь пептидов разделяется с помощью хроматографии и электрофореза. Эквивалентный вес полипептидной цепи рассчитывают по количеству аргинина и ли­ зина в белке и числу разных пептидов, получаемых при трипти­ ческом гидролизе. Теоретически общее число пептидов должно равняться сумме числа остатков аргинина и лизина плюс один,

если, конечно, С-концевой остаток не является аргинином или лизином. На практике, однако, часто встречаются некоторые от­ клонения вследствие медленного расщепления некоторых аргининовых и лизиновых связей, приводящего к тому, что дочерние и слаборасщепляющиеся исходные крупные пептиды могут отде­ ляться друг^от друга при дальнейшем фракционировании. Если триптический гидролиз длится.многие часы, то вследствие имею­ щегося в препарате трипсина даже незначительного, примесного количества химотрипсина могут появиться следовые количества «лишних» пептидов. Другая трудность заключается в том, что еще нет уверенности в абсолютной воспроизводимости самого метода пептидных карт. Поэтому очень важно делать одновре­ менно пептидные карты сравнения.

Основная проблема, однако, состоит в том, что белковая мо­ лекула, состоящая из идентичных субъединиц, будет давать пеп­ тидную карту с гораздо меньшим числом фрагментов, чем пред­ сказывает теория на основе только молекулярного веса. С другой стороны, изозим, состоящий из разных полипептндных цепей, может дать пептидную карту с большим числом пептидов, чем ожидается для идентичных полипептндных цепей и с меньшим числом пептидов, чем можно ожидать на основе молекулярного веса всей белковой молекулы, потому что некоторые части раз­ ных полипептидных цепей имеют идентичную первичную струк­ туру. Ферментативный гидролиз можно заменить нефермента­ тивным расщеплением пептидных связей, например при реакции белка с бромцианом. В этом случае расщепление полипептидных цепей происходит специфически по остаткам метионина [78].

10.2.5.Гибридизация

Если можно получить радиоактивно меченые молекулы бел­ ков, как, например, в случае бактерий, то для изучения четвер­ тичной структуры можно использовать метод гибридизации. При денатурации, приводящей к обратимой диссоциации белковых молекул на субъединицы, можно получить гибриды «тяжелых» и «легких» молекул и разделить затем эти гибриды центрифугиро­ ванием в градиенте плотности. Число субъединиц, появляющихся при денатурации, можно установить непосредственно по разли­ чиям плотностей гибридных тяжелых и легких молекул.

Мочевина или гуанидингидрохлорид вызывают обратимую диссоциацию р-галактозидазы на четыре компонента, которые, судя по измерениям диффузии и седиментации, должны быть одинаковыми по размеру (М компонента около 130 000, а М на­ тивного фермента 518 000) [79]. Были получены гибриды «легких» молекул этого белка (12С, 14N) и «тяжелых» молекул (13С, l5N) и сопоставлены их плотности при центрифугировании в градиенте

плотности [80]. Результаты вновь показали, что компонент диссо­ циации, полученный в присутствии мочевины, по своим размерам составлял четвертую часть целой молекулы фермента. Благо­ даря этому методу было установлено, что репликация ДНК следует полуконсервативному механизму [81].

10.2.6.Активные участки

Молекулы многих ферментов и респираторных белков имеют несколько активных участков [4, 45] (талб. 1). Пока еще не полу­ чены факты, указывающие на то, что отдельная полипептидная цепь (как в одноцепочечных, так и в многоцепочечных белках) может нести больше одного активного участка. В некоторых слу­ чаях активный участок локализован на каждой пептидной цепи многоцепочечиой молекулы (например, в алкогольдегидрогеназе печени лошади [39], лактатдегидрогеназе акулы [44], гемоглобине [16, 35], каталазе [54, 55] и, вероятно, в глицеральдегид-3-фосфат- дегидрогеназе [43, 48—50], алкогольдегидрогеназе дрожжей [45, 83] и L-6-гидроксиникотиноксидазе [40]). В других случаях только часть полипептидных цепей имеет активные центры. Пируватдекарбоксилаза, например, имеет только четыре молекулы биотина и диссоциирует на холоду на четыре субъединицы, но каждая субъединица состоит из трех полипептидных цепей [70]. В аспартаттранскарбамилазе (условный «состав» обозначается форму­ лой R6C6, см. табл. 1) шесть полипептидных цепей несут на себе активные участки, тогда как шесть других функционируют как регуляторные полипептидные цепи [57].

Пиридиннуклеотид-зависимые дегидрогеназы [45, 82] состав­ ляют группу ферментов, наиболее интенсивно исследуемую отно­ сительно связи четвертичной структуры и активного центра.Мо­

интервал от 50 000 до 200 000 (см. работу [45] и табл. 1). Из них дигидрофолатредуктазы [45, 84] и маннитол-1-фосфатдегидроге- наза [45] имеют самые низкие, а глутаматдегидрогеназы [9, 10] — самые высокие молекулярные веса.

Большинство дегидрогеназ состоит более чем из одной полипептидной цепи (две, четыре, шесть или восемь, т. е. всегда чет­ ное число). В большинстве случаев молекулярные веса полипеп­ тидных цепей не превышают 50 000. Они обычно почти равны эк­ вивалентным весам участков, связывающих кофермент, и, кроме того, один активный центр приходится на каждый участок, свя­ зывающий кофермент. Следовательно, оценка числа этих участ­ ков (а также субстрат-связывающих участков) у пиридиннуклео- тид-зависимых дегидрогеназ важна для характеристики четвер­ тичной структуры этих ферментов.