Файл: Кощеев, А. К. Люминесцентный анализ пищевых продуктов.pdf

Г л а в а V

МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИТАМИНОВ

Раздел 1. Определение фолиевой кислоты [2]

Принцип метода. Определение фолиевой кислоты сво­ дится к адсорбции ее активированным углем из вытяжек, последующей адсорбции и окислению десорбированного витамина перманганатом калия (с целью получения флу­ оресцирующего производного), измерению интенсивности флуоресценции в области максимума свечения (470 т р ) по сравнению со стандартным раствором.

Реактивы

2%-ный раствор серной кислоты Активированный уголь, обработанный анилином . Ак­

тивированный уголь заливают 10-кратным количеством 10%-ного водного раствора анилина, кипятят на электри­ ческой плитке под тягой при помешивании в течение 1ча­ са, промывают 5—6 раз дистиллированной водой, сушат при температуре 30—40° С и хранят в закрытой склянке. При обработке угля описанным способом уменьшается прочность адсорбции фолиевой кислоты и облегчается ее элюция.

3%-ный раствор аммиака в 70%-ном растворе спир­ та. Спирт предварительно проверяют на отсутствие лю­ минесценции, в случае ее наличия спирт перегоняют.

4%-ный раствор марганцовокислого калия

3%-ный раствор перекиси водорода Фолиевая кислота перекристаллизованная. Из нее го­

товят основной стандартный раствор растворением 20 мг кислоты в 100 мл воды, предварительно подщелоченный добавлением 3 капель 10%-ного раствора NaOH. 1 мл раствора содержит 0,2 мг, или 200 мкг, фолиевой кисло­ ты. Раствор хранят в темной склянке под толуолом на холоде.

66

Из основного раствора готовят рабочий стандартный раствор путем разведения 1 мл до 100 мл водой. В 1 мл такого раствора содержится 2 мкг фолиевой кислоты.

10%-ный раствор едкого натра Ферментные препараты: катадиастаз, полидаза или

высушенный мицелий гриба пенициллиума.

Методика исследования. Навеску исследуемого про­ дукта берут с таким расчетом, чтобы в вытяжке, подго­ товленной для определения флуоресценции, содержалось не более 2—3 мкг фолиевой кислоты в 1 мл. Для этой цели необходимо дрожжей и печени 1—2 г, зерновых продуктов 5—10 г, овощей и фруктов— 10 г.

Навеску тщательно растирают с кварцевым песком, переносят в колбу, заливают 75 мл воды и выдерживают на кипящей бане в течение 45 минут. После охлаждения жидкость разбавляют водой до 100 мл и фильтруют. За­ тем берут 50—75 мл фильтрата с точным учетом объема, подкисляют 2%-ной серной кислотой до pH 3. Для ад­ сорбции фолиевой кислоты добавляют 100 мг активиро­ ванного угля, предварительно обработанного анилином, как указано выше, кипятят в течение 5 минут на электри­ ческой плитке под тягой при помешивании и отфильтро­ вывают при вакууме через фильтр Шотта № 2 или стек­ лянный фильтр отечественного производства.

Десорбцию витамина проводят нагретым до кипения 3%-ным раствором аммиака в 70%-ном спирте 5 раз на том же фильтре Шотта. Общее количество элюирующей смеси равняется 70 мл; на первую десорбцию берут 20 мл, на вторую и третью — по 15 мл, на четвертую и пятую — по 10 мл.

Соединенные порции элюатов помещают в перегонную колбу со стеклянным шлифом и отгоняют до объема 10—15 мл. Остаток подкисляют 2%-ным раствором H2S 0 4 до pH 3 и подвергают обработке 4%-ным раство­ ром КМп04, добавляя раствор по каплям до стойкой ро­ зовой окраски. Смесь выдерживают при комнатной тем­ пературе в течение 10 минут, после чего добавляют по каплям 3%-ный раствор Н20 2 для удаления избытка пер­ манганата. Затем pH смеси доводят до 4—4,5, измеряют ее объем и фильтруют.

Фильтрат используют для измерения интенсивности флуоресценции в области максимума свечения (470 m\i). Интенсивность флуоресценции сравнивают с интенсивно-

етью флуоресценции стандартного раствора фолиевой кислоты.

Берут 10 мл рабочего стандартного раствора фолие­ вой кислоты (реактив 6), доводят pH до 3 и обрабаты­ вают КМп04 и Н20 2 как опытную вытяжку. После этого pH устанавливают в пределах 4—4,5, доводят объем рас­ твора до 20 мл. 1 мл полученного раствора содержит 1 мкг фолиевой кислоты. Измеряют флуоресценцию по­ лученного раствора.

Так как применяемые реактивы обладают флуорес­ ценцией, необходимо провести холостой опыт и получен­ ные результаты вычесть из данных основного опыта.

Содержание фолиевой кислоты в испытуемом продук­ те вычисляют по формуле

При исследовании продуктов, богатых белком, метод не приводит к полному извлечению фолиевой кислоты, поэтому приходится проводить дополнительную фермен­ тативную обработку продукта. С этой целью применяют катадиастаз, патентованный препарат типа «полидазы» или высушенный мицелий гриба пенициллиума.

Техника ферментативной обработки сводится к сле­ дующему. Первоначально водную вытяжку охлаждают, pH доводят до 4,5, добавляют 100 мг ферментативного препарата и помещают в термостат при температуре 40—45° С на ночь, затем pH доводят до 3, общий объем жидкости до 100 мл, фильтруют и для дальнейшего ис­ следования берут 50—75 мл фильтрата. Обработку ведут так, как описано выше.

■68

По данным Н. Андреевой, метод приводит к получе­ нию результатов, равным 86—113% содержания фолие­ вой кислоты в исследуемом продукте, что соответству­ ет обычной точности методов определения витаминов.

Определение фолиевой кислоты [43]

Навеску берут с таким расчетом, чтобы в вытяжке, идущей на определение, содержалось 2—3 мг фолиевой кислоты в 1 мл. Обычные навески для этого составляют Г—■2 г для дрожжей и печени, 5 г для зерновых продук­ тов и 10—15 г для зеленых частей растений, овощей и фруктов. Навеску тщательно растирают с кварцевым песком, переносят в колбу и выдерживают на кипящей водяной бане в течение 45 минут. После охлаждения объем доводят до 100 мл, вытяжку фильтруют. На даль­ нейшую обработку берут 50—70 мл фильтрата с точным учетом объема.

Для адсорбции фолиевой кислоты добавляют 100 мг предварительно подготовленного активированного угля. Вытяжку доводят до кипения, кипятят при помешивании в течение 5 минут, уголь отфильтровывают под ва­ куумом на фильтре Шотта № 3, далее уголь поступает на элюцию.

Подготовка угля для адсорбции. Навеску угля зали­ вают 10-кратным количеством 10%-ного водного раство­ ра свежеперегнанного и освобожденного от флуоресци­ рующих примесей анилина. Обработку ведут в течение 1, часа при кипячении и непрерывном помешивании, пос­ ле чего уголь отфильтровывают, промывают 5—6 раз дистиллированной водой на воронке Бюхнера, сушат при температуре 30—40° С и хранят в закрытой банке. Уголь, на котором адсорбировалась фолиевая кислота, обраба­ тывают на фильтре Шотта 5 раз горячим (60—70° С) 3%-ным раствором аммиака в 70%-ном этиловом спир­ те. Спирт предварительно проверяют на отсутствие флуо­ ресценции. Общее количество элюирующей смеси 70 мл; на первую обработку берут 20 мл, на вторую и третью — по 15 мл, на четвертую и пятую — по 10 мл.

Соединенные порции элюата помещают в перегонную колбу со стеклянным шлифом и отгоняют примерно до 10—15 мл, после чего pH доводят 25%-ной уксусной

69

кислотой до 3, экстракт подвергают обработке КМп04. Для обработки применяют 4%-ный раствор КМп04, кото­ рый по каплям добавляют до неисчезающей розовой окраски. Смесь выдерживают в течение 10 минут, к кон­ цу которых она буреет, но слабый розовый оттенок со­ храняется. Добавляют по каплям 3%-ную перекись во­ дорода до обесцвечивания, pH доводят до 4—4,5, заме­ ряют объем и фильтруют смесь.

Измеряют флуоресценцию фильтрата, используя при этом светофильтр с максимумом пропускаемости света при 470 тц . Интенсивность флуоресценции испытуемого образца сравнивают с интенсивностью флуоресценции стандартного раствора фолиевой кислоты. Основной

ной кислоты. В 1 мл стандартного раствора содержится 2 мг фолиевой кислоты. Реактивы обычно имеют флуо­ ресценцию, поэтому необходимо ставить холостой опыт, показания которого вычитаются из показаний опытного образца.

Холостой опыт ставится по той же прописи, но без ис­ пытуемого объекта.

Расчет содержания фолиевой кислоты производят в микрограммах на 1 г испытуемого материала по фор­ муле

v(А - В У С - Е

Хg -Д

70

чень, дрожжи) необходимо проводить дополнительную ферментативную обработку. При ферментативной обра­ ботке применяют такидиастаз, полидазу или мицелий гриба пенициллиум. Препараты должны быть очищены от флуоресцирующих примесей путем отмывания про­ мывных вод 10%-ным раствором сернокислого аммония до исчезновения флуоресценции.

Техника ферментативной обработки. Первоначальную кислотную вытяжку охлаждают до температуры 40е С, pH доводится до 4,7 с помощью 2,5М раствора уксусно­ кислого натрия, добавляют 100 мг ферментативного пре­ парата. Вытяжку с ферментативным препаратом поме­ щают в термостат при температуре 40—45° С на ночь, после чего pH доводят до 3, общий объем — до 100 мл. Вытяжку фильтруют, берут от нее 50—75 мл на даль­ нейшую обработку. При использовании ферментативной обработки холостой опыт проводят с добавлением фер­ мента.

Определение фолиевой кислоты в пищевых продуктах [12]

исследуемом объекте и от того, что определяется — сво­ бодная или общая фолиевая кислота. В навеске образ­ ца, взятой для проведения анализа, содержание фолиевой кислоты и ее производных должно быть не менее 2— 3 ,мкг, что соответствует 1—5 г сухого и 10—20 г свеже­ го образца.

Берут 2 навески (одну для определения свободной фолиевой кислоты, другую — для определения общего со­ держания фолатов), заливают в колбе ацетатным буфе­ ром pH 4,5 и нагревают на водяной бане в течение 5 ми­ нут. Во вторую колбу после охлаждения добавляют ферментный препарат из почек свиньи (100 мг на 1 г об­ разца; для продуктов с большим содержанием фолатов количество фермента увеличить). В обе колбы добав­ ляют по 2 капли толуола и оставляют в термостате на 24 часа при температуре 37° С.

Аналогично проводят определение фолатов в фер­ ментном препарате.

71

По истечении срока инкубации гидролизаты кипятят в течение 5 минут на водяной бане, охлаждают, доводят объем дистиллированной водой-до 50 мл, фильтруют или центрифугируют.

О ч и с т к а г и д р о л и з а т а от пр име с е й . Осаж­ дение белков хлорной кислотой. К части фильтрата до­ бавляют такое количество 57%-ного раствора хлорной кислоты, чтобы конечная концентрация ее составила 5%, и оставляют стоять на льду в течение 30 минут. Охлаж­ денный раствор фильтруют до получения прозрачного

льду на 10—15 минут и центрифугируют для удаления выпавшего осадка перхлората калия.

У д а л е н и е т и р о з и н а . К безбелковому фильтра­ ту добавляют 0,5 мл ледяной уксусной кислоты, 0,35 г уксуснокислой ртути, кипятят в течение 5 минут с обрат­ ным холодильником, охлаждают, добавляют 0,75 г хло­ ристого натрия, оставляют стоять на льду в течение 2 ча­ сов и центрифугируют. Доводят pH центрифугата аце­ татным буфером до 3,9—4,1, общий объем доводят дис­ тиллированной водой до 30 мл.

О к и с л е н и е ф о л и е в о й к и с л о т ы в птери- д и н - 6 - к а р б о н о в у ю к и с л о т у . К 7г полученного раствора по каплям добавляют 4%-ный раствор КМп04 до неисчезающей розовой окраски. Смесь выдерживают в течение 5 минут, избыток перманганата удаляют 3%-ным раствором перекиси водорода. pH раствора до­ водят до 3,9—4,1, измеряют объем и, если раствор мут­ ный, фильтруют. Вторую половину раствора доводят ди­ стиллированной водой до объема раствора, полученного после окисления.

Интенсивность флуоресценции растворов (до и после окисления) измеряют на флуорометре ЭФ-ЗМ со свето­ фильтром ФКОдновременно определяют интенсивность флуоресценции стандартного раствора фолиевой кисло­ ты (0,5 мкг/мл).

Содержание общей фолиевой кислоты вычисляют в миллиграмм-процентах по формуле

к - [07 - Л ) - ( f r - f l .,) ] -п- У-100

( ^ - ^ • г - ю о

72