Файл: Кощеев, А. К. Люминесцентный анализ пищевых продуктов.pdf

В2— до окисления;

п— содержание фолиевой кислоты в 1 мл стандарт­

ного раствора, мкг; g — навеска, г;

V— фактор разведения.

Расчет содержания свободной фолиевой кислоты ве­ дут по этой же формуле, исключив показания флуоро­ метра для раствора фермента (В i — В2).

Раздел 2. Определение витамина Bi (тиамина)

Определение свободного и общего тиамина [5]

Принцип метода. Витамин Bi окисляется щелочным раствором феррицианида калия в тиохром. Тиохром из­ влекают изобутиловым (изоамиловым, бутиловым) спир­ том. Спиртовой экстракт тиохрома под действием ульт­ рафиолетовых лучей дает сине-голубую флуоресценцию,, интенсивность которой находится в прямой зависимости от содержания тиохрома в экстракте.

Сравнивая интенсивность флуоресценции испытуемого раствора с интенсивностью флуоресценции стандартных растворов, определяют содержание тиамина в продукте. Описанный принцип использовал Янсен (1936) для хи­ мического определения тиамина. Позже метод Янсена модифицировал И. Мурри. Недочет метода Янсена и мо­ дификации Мурри — отсутствие стадии адсорбции тиами­ на, в связи с чем занижаются аналитические результа­ ты. В. Н. Букин и сотрудники устранили недостаток, разработав метод флуорометрического определения тиа­ мина, в основу которого положен метод Янсена в моди­ фикации Геннеси [42]. Необходимо отметить, что этот метод дает возможность определить свободный и об­ щий тиамин. Во втором случае испытуемый продукт по ходу анализа подвергается дополнительной обработке фосфатозой с целью перевода в свободный тиамин ко-

73

карбоксилазы путем отщепления от нее остатков фос­ форной кислоты.

Реактивы

Стандартный раствор тиамина: 10 мг тиамин-хлори­ да растворяют в 100 мл 0,01 н соляной кислоты. Сохра­ няют на холоде. 1 мл стандартного раствора доводят водой до 100 мл; рабочий раствор готовят в день опреде­ ления, раствор содержит 1 мкг тиамина в 1 мл

15%-ный раствор едкого натра 1%-ный раствор феррицианида калия. Раствор гото­

вят в день употребления. Препарат КзЕе(С19)6 дважды перекристаллизовывают из воды в затемненном месте. Для окисления вытяжек используют 0,04%-ный раствор КзРе(СМ)6 в 15%-ном растворе NaOH, для чего 4 мл ис­ ходного раствора вносят в 96 мл 15%-ного раствора. Ще­ лочной раствор КзРе(С1Ч)б годен для употребления в те­ чение 4 часов после приготовления

Сернокислый натр безводный 3%-ный раствор уксусной кислоты

Адсорбент типа пермутита — Na20Al20 3 • 3 S i0 2 • ■ 6 Н20. Пермутит кипятят в течение 15 минут с 10-крат­ ным количеством 3%-ной уксусной кислоты.

Авторы метода пользовались импортным адсорбентом «декальсо». А. Дмитровский доказал возможность при­ менения вместо препарата «декальсо» отечественного ка­ тионита СДВ-3. Хранить его следует под слоем воды.

Спирт проверить на отсутствие люминесценции (откло­ нение стрелки гальванометра флуорометра допустимо не более чем на 4—5 делений). Если спирт люминесцирует, перегнать его в приборе со стеклянными шлифами. Если после перегонки люминесценция не исчезнет, обработать

74

активированным углем (10—30 г на 1 л спирта) и вновь перегнать.

Ферментные препараты: клараза (патентованный ферментный препарат) или ферментный препарат из ми­ целия (Penicillium). Мицелий, отжатый от лишней влаги лабораторным прессом до содержания 25—30% сухих ве­ ществ, высушивают при температуре 45° С. Мелко расти­ рают и хранят в сухом и темном месте. Перед внесением в вытяжку ферментный препарат растереть в ступке с небольшим количеством раствора уксуснокислого натра. Рекомендуется проводить определение количества тиа­ мина в ферментных препаратах, если оно превосходит 0,1 мкг на 1г, вычесть из найденного в исследуемом про­ дукте тиамина то его количество, которое внесено с фер­ ментным препаратом.

Методика исследования. Навеску в 5—10 г помещают,

в ступку с небольшим количеством 0,1 н H2S 0 4 и тща­ тельно растирают. Массу переносят количественно в кол­ бу при помощи 0,1 н H2S 0 4; при этом общее количество кислоты должно быть равно 40—70 мл. Колбу помещают на кипящую водяную баню, часто встряхивают, не давая плотным частицам вещества оседать на стенках. Экстрак­ цию ведут в течение 45 минут. Охлаждают содержимое колбы до температуры 50° С, добавляют 2,5 М раствора уксуснокислого натра до pH 4,5-5 (по универсальному индикатору).

Исследуя свободный тиамин, жидкость доводят до определенного объема, фильтруют и для дальнейшего ис­ следования берут 10—20 мл вытяжки.

‘При определении общего содержания тиамина после доведения pH вытяжки до 4,5—5 добавляют ферментный препарат (30 мг на 1 г сухого вещества навески). Пре­ парат растирают с раствором уксуснокислого натра. Колбу закрывают ватной пробкой и выдерживают в тер­ мостате. при температуре 37° С в течение 12—16 часов. Раствор охлаждают, доводят объем дистиллированной водой до 50—100 мл и после тщательного перемешива­ ния фильтруют. 10—20 мл фильтрата берут для дальней­ шего исследования. Далее ход определения свободного и общего тиамина одинаков. Разница между обоими оп­ ределениями дает величину связанного тиамина.

Следующая операция в анализе — адсорбция тиами­ на. Для адсорбции пользуются трубкой, которая спаяна

75

из трех трубок разного диаметра: длиной 9, диаметром- 2,5 см; длиной 15, диаметром 0,7 см; капиллярной труб­ ки— длиной 3, диаметром 1 мм.

В нижнюю часть второй трубки помещают комочек стеклянной ваты так, чтобы волокна лежали поперек от­ верстия, насыпают адсорбент высотой 6 см (в случае применения «декальсо»). При использовании других адсорбентов высота столбика может быть больше или меньше в зависимости от адсорбционных свойств адсор­ бента.

Промывают адсорбент 10 мл 3%-ной уксусной кисло­ ты, после чего в трубку вводят от 10 до 20 мл исследуе­ мой вытяжки. После прохождения жидкости адсорбент промывают 3 раза дистиллированной водой, беря на каж­ дое промывание по 10 мл. Тиамин адсорбирован на ко­ лонке. Далее следует операция элюции. Тиамин элюируют с адсорбента горячим 25%-ным раствором КС1 в 0,1 к НС1. Жидкость собирают в градуированный цилиндр до тех пор, пока объем ее не окажется равным 25 мл.

В две цилиндрические делительные воронки прили­ вают по 5 мл полученного раствора; в первую воронку прибавляют в качестве окислителя 3 мл смеси 0,04%-ноп> раствора феррицианида в 15% растворе NaOH, пе­ ремешивают, для экстрагирования образовавшегося тиохрома прибавляют 12 мл изобутилового или изоамилового спирта. Во вторую контрольную делительную воронку прибавляют 3 мл 15%-ного раствора NaOH (без ферри­ цианида), перемешивают и прибавляют 12 мл изобутило­ вого спирта. Обе воронки встряхивают в течение 1,5 ми­ нуты. После расслоения жидкости сливают и отбрасыва­ ют нижний водный слой. В оставшийся в воронке спир­ товой раствор добавляют около 2 г безводного Na2S04, встряхивают, просветленный раствор употребляют для флуорометрии. Раствор должен быть прозрачным, в про­ тивном случае добавляют безводный Na2S 0 4 и дают от­ стояться. Совершенно прозрачный раствор переносят в- кювету.

Параллельно проводят окисление стандартного рас­ твора тиамина, для чего в две делительные воронки вно­ сят по 1 мл рабочего раствора тиамина, содержащего 1 мкг витамина, добавляют по 4 мл воды. В одну ворбнку вносят щелочной раствор феррицианида, во вто­ рую-— щелочной раствор без феррицианида (контроль)^

76

Окисление тиамина и извлечение тиохрома производят так, как описано выше.

Для количественного определения используют флуорометр со специфическим светофильтром с максимумом поглощения около 390 /пц и одинаковыми пробирками или кюветами из нелюмииесцирующего стекла.

В каждую из пробирок (кювет) вводят около 8 мл испытуемых окисленных и неокисленных изобутиловых растворов, а также изобутиловые растворы окисленно­ го и неокисленного стандартного раствора тиамина, ин­ тенсивность флуоресценции определяют по шкале ^гальванометра.

Расчет производят по формуле

где X — содержание тиамина в 1г продукта, мкг;

А — показания флуорометра для испытуемого образ­ ца с окислителем;

В — показания флуорометра для испытуемого об­ разца без окислителя;

А\ — показания флуорометра для стандартного рас­ твора с окислителем;

В \ — показания флуорометра для стандартного рас­ твора без окислителя;

g — навеска образца, г;

V)— общий объем, до которого доведена вытяжка после кислотного или ферментативного гид­

ролиза, мл;

V2— объем вытяжки, взятой для адсорбции, мл; | У3 — общий объем элюата, мл;

У4 — объем элюата, взятого для окисления, мл.

Полученный по формуле результат показывает содер­ жание тиамина в микрограммах на 1 г продукта; для пе­ ресчета в миллиграмм-проценты результат разделить на 10.

В случае отсутствия флуорометра определение ведет­ ся визуально при помощи флуороскопа. При флуороскопировании заготовить серию эталонов с определенным содержанием тиамина: 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5 мкг для объек­ тов с малым содержанием тиамина; 0,5,' 0,75, 1,0, 1,25, 1,5, 1,75, 2,0 мкг для объектов с относительно большим содержанием тиамина (драже, витаминизированные

77

конфеты). Эталоны сравнивают с испытуемым раствором в ультрафиолетовом свете, излучаемом ртутно-кварцевой лампой типа ПРК-4. Пробирки со стандартными и ис­ пытуемыми растворами помещают под утлом 45—60° к плоскости фильтра. Подбирают из стандартных проби­ рок ту, которая по интенсивности флуоресценции совпа­ дает с опытной.

Если не удастся подобрать эталон, точно совпадаю­ щий по интенсивности флуоресценции с испытуемым рас­ твором, то путем разбавления раствора изобутиловым (изоамиловым) спиртом, прибавленным из микробюрет­ ки (микропипетки), уменьшают интенсивность флуорес­ ценции до тех пор, пока она не совпадет с интенсивно­ стью ближайшего эталона, и рассчитывают концентра­ цию тиамина в опытной пробирке.

По И. Мурри [16], опытные вытяжки дотитровывают раствором тиохрома до флуоресценции стандартного рас­ твора окисленного тиамина, что дает возможность рас­ считать содержание тиамина в опытной пробирке.

Флуороскопирование производят в затемненной ком­ нате после достаточной адаптации глаза к темноте. Наи­ более точная оценка интенсивности флуоресценции полу­ чается при первом зрительном впечатлении (после за­ крывания глаз на одну минуту).

Примечание 1. Применение резиновых пробок в ра­ боте недопустимо. Для смазывания кранов делительных воронок (цилиндров) и бюреток можно пользоваться ва­ зелиновым маслом, не дающим люминесценцию.

Примечание 2. Так как иногда фильтры обусловли­ вают люминесценцию профильтрованной жидкости, ре­ комендуется предварительно промывать их изобутило­ вым (изоамиловым) спиртом до тех пор, пока промыв­ ной спирт не перестанет люминесцировать. После этого фильтры высушивают. Хранят их в закрытой склянке.

Определение тиамина [43]

Принцип метода. В щелочной среде под действием красной кровяной соли тиамин количественно окисляет­ ся в тиохром, который, будучи извлечен из реакционной смеси изобутиловым спиртом, дает под действием ульт­ рафиолетовых лучей сине-голубую флуоресценцию. Коли­ чественно ее определяют либо на флуорометре, либо на

78

флуороскопе путем непосредственного визуального срав­ нения с раствором, в котором известно содержание тиа­ мина.

Применимость метода. Метод применим для опреде­ ления тиамина в препаратах и пищевых продуктах. При исследовании драже, таблеток, ампул ход анализа наи­ более прост. Навеску разводят до определенной концен­ трации, после чего проводят окисление тиамина в тиохром. Анализ пищевых продуктов осложняется необхо­ димостью освобождения тиамина из связанного состояния.

Как известно, в большинстве природных источников тиамин встречается в виде пирофосфата (кокарбоксилаза). Последний, являясь активной группой ряда фермен­ тов углеводного обмена, находится в определенных свя­ зях с белком. Освобождение тиамина из связанного со­ стояния осуществляется энзиматическим путем, воздей­ ствием пирофосфатаз и в ряде случаев протеолитических ферментов.

В качестве источника пирофосфатазы рекомендуется применять очищенные энзиматические препараты из пле­ сеней Aspergillus oryzae.

Анализ затруднен также наличием в ряде объектов примесей, обладающих люминесценцией (как правило, желто-зеленой). Примеси, маскируя флуоресценцию тиохрома, искажают результаты анализа и делают невоз­ можным применение флуороскопа без специальных об­ работок проб.

Удаление посторонних примесей достигают путем ад­ сорбции элюции в адсорбционных колонках. Адсорбен­ том могут служить некоторые глины (асканит), а также ионнообменные смолы (катионит СДВ-3). Многие объек­ ты (молоко, мясо, картофель, белый хлеб) содержат не­ значительное количество люминесцирующих примесей, поэтому при их исследовании нет необходимости упот­ реблять адсорбционные колонки. В этом случае примеси удаляют отмывкой экстрактов бутиловым спиртом.

В зерновых культурах тиамин находится главным об­ разом в свободном состоянии, но анализ объектов ослож­ нен наличием в них крахмала, который, адсорбируя тиа­ мин, препятствует его количественному определению. Удаление крахмала достигается также в ходе фермента­ тивного гидролиза воздействием амилаз, которыми бога­ ты препараты из плесени Aspergillus. Оптимумы pH пи­

79