Файл: Новые методы анализа аминокислот, пептидов и белков..pdf

Мондиио [147] показал, что по его новой системе автомати­ ческого анализа аминокислот расчет количества вещества в эффлюенте можно производить только по высоте пика. Этот метод включает две операции: проведение фоновой линии и измерение от нее высоты пика. Предполагаемая ошибка такого измерения почти не зависит от формы пика; для пика высотой приблизи­ тельно 10 см ошибка измерения составит около 0,13%. Если ус­ ловия опыта (нанесение пробы, скорость течения буфера и т. п.) отвечают определенным требованиям, измерение одной лишь вы­ соты дает наибольшую точность из всех известных ручных мето­ дов нахождения площади пиков.

Шредер и сотр. [148] описали устройство и использование «номограммы», которая позволяет рассчитывать результаты ами­ нокислотного анализа в течение 5 мин. Оценка применимости этого метода по сравнению с обычным методом расчета пло­ щади пиков (H-W/ C) показала, что при концентрации аминокис­ лот в пределах 0—0,3 мкмоль расхождения в результатах рас­ чета не превышают ±5% ; в четырех из пяти опытов расхождение в результатах было в пределах ±2% .

Для обсчета площади пиков применяются также электронные

имеханические интеграторы, но мы пришли к заключению, что расчет концентрации, основанный на измерении только высоты пика, вполне пригоден для большинства случаев. Добавление внутреннего стандарта к неизвестной пробе до анализа показы­ вает любое отклонение от нормальных ожидаемых величин (ме­ ханические потери, химические изменения, замена оборудова­ ния*). Норлейцин — или, еще лучше, гомоцитруллин [139] — удо­ бен для использования при хроматографическом анализе кислых

инейтральных аминокислот; он элюируется вслед за лей­

цином.

L-2-Амино-З-гуанидинпропионовая кислота ** рекомендуется для короткой колонки при анализе основных аминокислот белко­ вых гидролизатов; она элюируется между аммиаком и аргини­ ном [149].

* Имеется в виду неточный перенос пробы в колонку, изменение моляр1 пости и pH буферов н нингидринового реагента, а также любая ремонтная операция, проводимая с анализатором после калибровочного анализа. —

Прим, перед.

** Норлейцин и L-2-аммно-З-гуаиидпнпропнновую кислоту производит фирма «California Corporation for Biochemical Research».

1.6. РЕКОМЕНДУЕМЫЕ МЕТОДИКИ

Из большого числа существующих методик анализа амино­ кислот ниже приведены только те, которые используются в на­ шей лаборатории, поскольку мы имеем наибольший опыт их применения *.

1.6.1. Подготовка пробы

1.6.1.1. Гидролнз

Мур и Стейн [137] описали условия гидролиза пробы, позво­ ляющие избежать окисление аминокислот кислородом воздуха. Эта методика состоит в следующем.

1)В пробирку размером 16-125 мм из стекла пирекс с неза­ кругленными краями помещают 2 мг сухого белка или эквива­ лентное количество водного раствора белка.

2)К сухой навеске белка в пробирке добавляют 0,5 мл дис­ тиллированной воды и 0,5 мл концентрированной соляной кис­ лоты. Если проба белка уже растворена, добавляют равный объ­ ем концентрированной соляной кислоты.

3)К краю пробирки слегка припаивают стеклянную палочку, служащую в качестве ручки, после чего перетягивают пробирку

впламени кислородной горелки таким образом, чтобы получился капилляр диаметром 1—3 мм и длиной около 1,5 см.

4)Осторожно отделяют стеклянную палочку и охлаждают нижнюю часть пробирки в смеси сухого льда с этанолом.

5)После того как содержимое пробирки затвердеет, про­ бирку присоединяют к вакуумному насосу для откачивания воз­ духа (по меньшей мере до 0,05 мм рт. ст.).

6)Затем пробирку запаивают на месте «перетяжки» на ост­ ром пламени кислородной горелки.

7)Запаянную пробирку помещают на 22 ч в термостат с принудительной циркуляцией воздуха и поддерживают темпера­ туру 110 ± 1 °С.

8)По окончании гидролиза пробирку вскрывают, предвари­ тельно охладив до комнатной .температуры.

9)Для удаления соляной кислоты вскрытую пробирку поме­ щают в вакуум-эксикатор над гранулированным едким натром

под углом в 15—20° относительно дна эксикатора. Затем эксика­ тор постепенно вакуумируют на водоструйном насосе.

* Эти методики разработаны для ионообменных смол и аминокислотных анализаторов фирмы «Бекман». Однако при подборе соответствующих смол данные методики можно взять за основу при использовании на других типах анализаторов с учетом конструктивных особенностей и возможностей послед­ них. — Прим, перев.

10)Для растворения и доведения pH пробы до значения, не­ обходимого для разделения на ионообменной колонке, к остатку добавляют 2,0 мл 0,20 и. натрийцитратного буфера с pH 2,2.

11)В 400 мкл полученного раствора будет содержаться 0,4 мг

пробы или приблизительно 0,1 мкмоль каждой аминокислоты.

1.6.1.2.Отделение белка

Отделение с помощью сульфосалициловой кислоты

1)Отбирают 1,0 мл цельной крови.

2)Переносят ее в коническую центрифужную стеклянную

пробирку (на 5 мл) и дают свернуться.

3)Сгустки крови удаляют со стенок пробирки небольшой стеклянной палочкой и перемешивают со всей пробой.

4)Пробу центрифугируют при 2500—3500 об/мин в течение 15 мин (с использованием стандартного 10-дюймового ротора).

5)Затем микропипеткой отбирают 500 мкл плазмы и пере­ носят ее количественно в чистую центрифужную пробирку.

6)К 500 мкл плазмы добавляют 500 мкл 3%-ного водного раствора сульфосалициловой кислоты (15 мг) и тщательно пере­

мешивают на подходящем встряхивателе.

7) После перемешивания выпавший белок отделяют центри­ фугированием при 2500—3500 об/мин.

8) Отбирают 0,5 мл чистого супернатанта, содержащего 250 мкл исходной плазмы, и наносят прямо на ионообменную колонку. Этого количества достаточно для анализатора, имею­ щего кювету 6,6 мм и самописец на 1 мВ.

Отделение белка центрифугированием

1) Отбирают 1,0 мл цельной крови и переносят ее в коничес­ кую центрифужную пробирку на 5 мл.

2) Добавляют 1,0 мл 0,20 н. натрийцитратного буфера с pH 2,2 и выдерживают в холодильнике в течение 30 мин.

3) Затем центрифугируют при 18 000• g- в течение 30 мин или при 78 000-£ в течение 20 мин.

4) 0,5 мл чистого супернатанта, составляющего 25% исход­ ной плазмы, наносят прямо на колонку. Этого количества доста­ точно для анализатора, снабженного кюветой 12 мм и имеющего шкалу самописца 4,5—5,0 мВ.

1.6.1.3.Анализ мочи

При анализе мочи прежде всего из нее необходимо удалить аммиак. Особенно это важно в тех случаях, когда определяются основные аминокислоты. При хранении проб мочи более двух суток их помещают в пластиковые флакончики и хранят в холо­ дильнике в замороженном состоянии. При суточном сборе к моче

52 ГЛАВА I

в качестве антисептика добавляют 1 мл толуола. Если в моче определяются только кислые и нейтральные аминокислоты, то нет необходимости предварительно удалять весь аммиак. Доста­ точно только довести pH пробы до значения 2,0 и отцентрифугировать коллоидный осадок.

Для удаления аммиака поступают следующим образом.

1) К. 0,5 мл мочи добавляют 2 н. NaOH до величины pH 11,5—12,0 (по индикаторной бумаге). Отмечают, какой объем щелочи потребовался для этой цели.

2) Пробу помещают в вакуум-эксикатор над концентриро­ ванной серной кислотой и непрерывно вакуумируют на водо­ струйном насосе в течение 6 ч до удаления аммиака.

3) Доводят pH пробы 6 н. соляной кислоты до значения

2, 0— 2, 2.

4)Затем пробу фильтруют или центрифугируют при 2500— 3500 об/мин на 10-дюймовом роторе с использованием пробирок для фильтрования. Время фильтрования (10—30 мин), конечно, зависит от количества коллоидного осадка.

5)Пробу и промывочные воды переносят в мерную колбочку на 1,0 мл и доводят объем до метки 0,2 н. натрнйцитратным буфером с pH 2,2.

6)0,2 мл полученного таким образом раствора эквивалентно

0,1 мл исходной мочи.

1.6.1.4.Подготовка других проб

Методики взятия и подготовки проб из экстрактов животных и растительных тканей, пищевых продуктов и других источников приведены в книге С. Блакбурна (Amino Acid Determination Methods and Techniques, Marcel Dekker Inc., New York).

Общим для всех таких проб является то, что перед нанесе­ нием на колонку их разбавляют 0,2 н. натрийцитратным буфе­ ром с pH 2,2. (Пробу разбавляют до объема 0,20—1,5 мл, наи­ более удобного для нанесения на колонку и для получения хо­ роших результатов.)

1.6.2.Приготовление буферных растворов

Буферные растворы, необходимые для элюирования амино­ кислот из колонки, готовят на дистиллированной или деионизи­ рованной воде высокой степени чистоты.

По разработанным ранее рецептурам в буферные растворы рекомендовалось добавлять детергент типа Brij-35, способствую­ щий растворению газов в колонке. Однако при его добавлении несколько ухудшалось разделение (например, пары глицин — аланин) в результате изменения скорости элюирования некото­ рых аминокислот. Замена молотых и порошкообразных смол