Файл: Новые методы анализа аминокислот, пептидов и белков..pdf

58 ГЛАВА I

фильтром высотой 0,5 см. Закрывают кран под колонкой. Теперь колонка готова для заполнения смолой.

К смоле, без предварительной ее обработки, добавляют два объема (по отношению к объему колонки) 0,2 н. натрийцнтратного буфера pH 3,2, не содержащего какого-либо детергента.

Растворенный воздух удаляют из суспензии смолы в буфере путем деаэрирования. Благодаря этому в колонке не образуются воздушные «карманы» и частички смолы упаковываются равно­ мерно. Для этого стакан с суспензией смолы в буфере помещают в вакуум-эксикатор (без подставки и осушителя) и откачивают воздух на водоструйном насосе до тех пор, пока не перестанут выделяться пузырьки воздуха (10—15 мин). Воздух можно так­ же удалить, используя сосуд для фильтрования под вакуумом. Горло сосуда затыкают пробкой, создают вакуум и часто вра­ щают сосуд для перемешивания смолы и облегчения удаления пузырьков газа. Обычно на эту процедуру требуется 15—20 мин.

Колонку набивают секциями, для того чтобы обеспечить рав­ номерность заполнения смолой и уменьшить попадание воздуха. Перед добавлением в колонку очередной порции суспензии ее осторожно перемешивают стеклянной или фторопластовой палоч­ кой. При закрытом кране в колонку наливают по стенке первую порцию суспензии (примерно на 2 см ниже верха колонки) и дают смоле осесть, так чтобы над фильтром образовался слой смолы высотой 2—4 см (на это обычно требуется от 5 мин и бо­ лее). Затем в колонку вводят верхний фитинг.

Заполнение колонки производят с помощью насоса при ско­ рости подачи буфера 68 мл/ч и температуре 55 °С. После того как смола осядет, избыток буфера осторожно отбирают, не на­ рушая слоя смолы, и добавляют новую порцию суспензии. Эту операцию повторяют до тех пор, пока не будет достигнута необ­ ходимая высота столбика смолы — 56 см для длинной и 5,5 см для короткой колонки. Каждая колонка регенерируется 0,2 н. едким натром с последующим уравновешиванием стартовым буфером.

около 9 атм, а продолжительность анализа составляет 180 мин, включая определение фенилаланина.

Основные аминокислоты. При использовании смолы РА-35 Элюирование основных аминокислот начинается при тех же ско-

Время, мин

*Рис. 1. Анализ калибровочной смеси аминокислот, содержащей по 0,25 мкмоль каждой аминокислоты.

Основные аминокислоты разделялись на короткой колонке (5 см) со сферической смолой РА-35. Кислые и нейтральные аминокислоты разделялись на длинной колонке (56 см) со смолой UR-30.

1.6.4.1. При этом высота столбика смолы должна быть 26 см. Для заполнения колонки используют 0,2 н. натрийцитратный бу­ фер pH 3,545 (0,20 М по цитрату). Условия анализа описаны в разд. 1.6.6.

1.6.5.Методика анализа физиологических жидкостей

По этой методике анализируют аминокислоты и родственные им соединения, реагирующие с нингидрином, которые обычно присутствуют в физиологических жидкостях. Перечень этих сое­ динений приведен в разд. 1.3.1.2. Ниже подробно описаны про­ цедуры анализа физиологических жидкостей на смолах UR-30

и UR-40.

1.6.5.1.Анализ с использованием смолы UR-30

Анализ кислых и нейтральных аминокислот с использова­ нием натрийцитратных буферов. Для этой цели можно исполь­ зовать ту же колонку длиной 56 см, которая применяется для анализа белковых гидролизатов. Заполнение колонки описано в разд. 1.6.4. Режим анализа следующий: скорость подачи бу­ фера 50 мл/ч, нингидринового реагента — 25 мл/ч; стартовый буфер — 0,2 и. натрийцитратный буфер с pH 3,20 + 0,01, не со­ держащий детергента (табл. За); начальная температура 32,3°С. Через 90 мин после начала анализа температуру колонки повы­ шают до 62,0°С (постепенно, в течение 55—60 мин). Через 158 мин после начала анализа стартовый буфер заменяют 0,2 н. натрийцитратным буфером с pH 4,26+0,02. Нормальное давле­ ние на колонке при 32,3 °С составляет 12,7 атм; весь анализ про­ ходит за 320 мин. Типичная кривая показана на рис. 2.

Анализ основных аминокислот. Для анализа этих аминокис­ лот используют смолу РА-35 при высоте столбика смолы 23 см. Скорость подачи буфера и нингидринового реагента та.же, что и при анализе кислых и нейтральных аминокислот. Анализ на­ чинают с 0,38 н. натрийцитратного буфера pH 4,25 + 0,01 (см. табл. За) при 32,3 °С, который на 185-й минуте заменяют на 0,35 н. натрийцитратный буфер pH 5,36 + 0,01; одновременно по­ вышают и температуру в рубашке колонки до 62,0 °С, используя тот же температурный градиент. Нормальное давление на ко­ лонке при 32,3 °С составляет 14,8 атм, а продолжительность ана­ лиза— 345 мин (см. рис. 2). В целом анализ кислых, нейтраль­ ных и основных аминокислот физиологических жидкостей зани­ мает немногим более 11 ч.

Анализ кислых и нейтральных аминокислот с использованием литийцитратных буферов. Разделение аспарагина и глутамина в присутствии других аминокислот всегда представляет собой