Файл: Новые методы анализа аминокислот, пептидов и белков..pdf

которому путем ультрацептрмфугироваммя удаляется ■только часть растворимых белков, перед тем как проба наносится на колонку с ионообменником. Утверждают, что этот метод яв­ ляется более удобным и быстрым, чем методы отделения белка с помощью пикриновой или сульфосалициловой кислоты.

Повышенная (путем электронного усиления) чувствитель­ ность анализаторов аминокислот и улучшенное разделение хроматографических пиков позволяет вводить небольшие пробы. Несмотря на то что можно количественно определить 10—20 на­ номолей аминокислоты (0,1 мл сыворотки), описанные в разд. 1.6.1 способы приготовления проб рассчитаны на несколь­ ко большие количества, с тем чтобы при необходимости можно было повторить анализ.

1.4.2.Заполнение колонки

Хорошее разделение аминокислот зависит в первую очередь от ионообменной колонки. При приготовлении колонки, которая давала бы высокую степень разделения, важно позаботиться о том, чтобы не допустить каких-либо изменений, которые могут привести к нарушениям и погрешностям в работе колонки. Имеется две основных причины плохого заполнения колонки: воздух, попавший в смолу, и примеси в смоле на верхней части колонки. Одной из наиболее обычных причин, мешающих пра­ вильной работе колонки, является накопление воздуха на по­ верхности смолы и образование воздушных карманов. Иногда пузырьки газа продвигаются вниз по колонке и застревают внизу на фильтре, удерживающем столб ионообменной смолы. Это заметно ограничивает поток буфера и размазывает пик лю­ бой аминокислоты, которая выходит из колонки. Скопившийся воздух иногда выгоняется из колонки во время цикла регенера­ ции гидроокисью натрия. В случае скопления заметного количе­ ства газа на смоле (вызывающего образование воздушных кар­ манов) может нарушиться не только разделение, но и значитель­ но повыситься рабочее давление на колонке. Вторая причина — наличие загрязнений, плесени или белковоподобного материала— не позволяет соответствующим образом «наслоить» или нанести пробу на колонку, в результате чего получаются размазанные или несимметричные пики и, кроме того, увеличивается рабочее давление.

Каждое из вышеуказанных обстоятельств, препятствующих нормальному течению буфера через смолу, приводит к посте­ пенному повышению давления на колонке. Если давление про­ должает нарастать, то смола в таких условиях обычно сжимает­ ся, создавая чрезмерно высокое рабочее давление. Поскольку при этом уменьшаются канальцы жидкости между частицами

смолы и ухудшается контакт между буфером и смолой, то ухуд­ шается и разделяющая способность колонки. В таком случае колонку необходимо набить заново. Для набивки колонки мы рекомендуем способ, который описан в разд. 1.6.

1.4.3.Влияние величины pH буфера

1.4.3.1.Влияние pH буфера при анализе белковых гидролизатов

Четырехчасовой метод анализа, смолы UR-30, РА-35. Уве­ личение pH первого буфера (pH 3,25; 0,20 и. раствор) для кис­ лых и нейтральных аминокислот всего на несколько сотых до­

быстрее по сравнению с другими основными аминокислотами.

Двухчасовой метод анализа, смола UR-30 для кислых и ней­

пиков аминокислот треонина и серина. Кроме того, ухудшается разделение между пиками серина и глутаминовой кислоты, гли­ цина и аланина. Цистин в этом случае элюируется быстрее и лучше отделяется от глицина.

Одноколоночный метод анализа, смола UR-30. При постоян­ ной температуре колонки, концентрации цитрат-ионов и ионов натрия и скорости течения буфера варьируют величину pH первого буфера. Ее увеличение с 3,28 до 3,31 ухудшает разделе­ ние треонина и серина. Цистин элюируется быстрее, но при этом ухудшается разделение глицина и аланина. Увеличение pH вто­ рого буфера с 4,30 до 4,50 при прочих неизменных условиях ана­ лиза ухудшает разделение как метионина и изолейцина, так и изолейцина и лейцина. Увеличение pH третьего буфера позволяет элюировать гистидин быстрее.

Одноколоночный метод анализа, смола UR-40. Поддерживая постоянными температуру колонки, концентрацию ионов натрия и цитрат-ионов и скорость течения буфера, варьируют величину pH первого буфера. Понижение pH с 3,545 до 3,515 ухудшает разделение треонина и серина (отношение высоты впадины к высоте пика равно 0,07; определение этого понятия см. в разд. 1.5.1). Цистин элюируется из колонки медленнее, но разде­ ление серина и глутаминовой кислоты улучшается приблизитель­ но до 0,19. Увеличение pH второго буфера с 4,25 до 4,30 при прочих неизменных условиях' анализа ухудшает разделение изо­ лейцина и лейцина. При увеличении pH третьего буфера гисти­ дин элюируется быстрее.

1.4.3.2.Влияние pH буфера при анализе физиологических жидкостей

Кислые и нейтральные аминокислоты, смола UR-30, натрий-

цитратные буферы. Увеличение pH буфера со значения 3,20 (0,20 н.) до 3,26 (0,20 н.) улучшает разделение аспарагиновой кислоты и треонина приблизительно до 0,10 (отношение высоты впадины к высоте пика). Цистин элюируется быстрее, а глута­ миновая кислота перемещается ближе к пролину. Разделение глицина и аланина ухудшается. Увеличение pH буфера оказы­ вает общее влияние на элюирование аминокислот: они элюи­ руются из колонки быстрее.

Кислые и нейтральные аминокислоты, смола UR-30, литий-

цитратные буферы. При увеличении pH первого буфера (прочие условия остаются неизменными) с 2,80 до 3,13 аспарагин и глу­ таминовая кислота вымываются в виде одного пика. Ухудшается также разделение пролина и а-аминоадипиновой кислоты. Даль­ нейшее увеличение pH до 3,27 приводит к ухудшению разделения таурина и фосфоэтаноламина. Аспарагин и глутаминовая кис­ лота все еще элюируются совместно, но разделение цитруллина и а-амино-н-масляной кислоты улучшается. При повышении pH большинство аминокислот, как правило, вымываются из колонки быстрее.

Кислые и нейтральные аминокислоты, смола UR-40. При по­ стоянных значениях температуры колонки, концентрации ионов натрия и цитрат-ионов и постоянной скорости течения буфера

(отношение высоты впадины к высоте пика). В результате уве­ личения pH буфера на 0,011 цистин выходит быстрее на 1 мин, раньше элюируется глутаминовая кислота, но, кроме того, сжи­ маются пики трех аминокислот — пролина, глутаминовой кис­ лоты и цитруллина. При увеличении pH буфера ухудшается раз­ деление глицина и аланина.

Основные аминокислоты, смола UR-40. При постоянных тем­ пературе колонки, концентрации и скорости течения буфера уменьшение pH с 4,148 (0,40 н. раствор) до 4,080 (0,40 н. рас­ твор) оказывает следующее влияние: у-амино-н-масляная кис­ лота задерживается примерно на 3 мин, улучшается разделение этаноламина и аммиака приблизительно до 0,09 (соотношение высот впадины и пика), а разделение лизина и 1-метилгистидина ухудшается до 0,50. Подвижность гистидина сильно зависит от

величины pH буфера: он элюируется позже, когда pH буфера понижается.

Основные аминокислоты, смола РА-35. Уменьшение величины pH первого буфера с 4,25 до 4,20 (0,38 н. раствор) улучшает

разделение этаноламина и аммиака до 0,09 (соотношение высот впадины и пика). В то же самое время разделение лизина и 1-метилгистидина ухудшается до 0,50. Изменение pH второго бу­ фера влияет на разделение триптофана и карнозина. При увели­ чении pH этого буфера не только ухудшается разделение этих аминокислот, но и их пики перекрываются с пиками ансерина

икреатинина.

1.4.4.Влияние концентрации ионов натрия

1.4.4.1.Влияние концентрации ионов натрия при анализе белковых гидролизатов

Четырехчасовой метод, смола UR-30. Уменьшение концентра­ ции ионов натрия ниже 0,20 н. приводит к расширению пиков и замедлению элюирования аминокислот из колонки. Наблюдается незначительное улучшение разделения пиков последней части хроматограммы, но не за счет продолжительности анализа.

Двухчасовой метод, смола UR-30. При увеличении концентра­ ции ионов натрия аминокислоты элюируются из колонки слиш­ ком быстро, в результате чего ухудшается разделение треонина и серина, а также серина и глутаминовой кислоты.

Одноколоночный метод, смола UR-30. Поддерживая постоян­ ными концентрацию цитрат-ионов, температуру колонки и ско­ рость течения буфера, варьируют концентрацию ионов натрия в третьем буфере. При уменьшении нормальности буфера с 1,4 до 1,0 триптофан элюируется быстрее, а аргинин медленнее. Кроме того, при меньшей нормальности третьего буфера фоновая линия становится ниже. В общем уменьшение концентрации ионов нат­ рия задерживает выход большинства аминокислот.

Одноколоночный метод, смола UR-40. При неизменных тем­ пературе колонки, концентрации цитрат-ионов и скорости тече­ ния буфера уменьшение концентрации ионов натрия приводит к задержке выхода' большинства аминокислот. При уменьшении нормальности третьего буфера с 1,8 до 1,4 не только задержи­ вается элюирование основных аминокислот, но и значительно по­ нижается фоновая линия, обычно наблюдаемая при большей кон­ центрации буфера.

1.4.4.2.Влияние концентрации ионов натрия при анализе физиологических жидкостей

Кислые и нейтральные аминокислоты, смола UR-30, натрий-

цитратные буферы. При увеличении концентрации ионов натрия большинство аминокислот элюируется быстрее. Время элюиро­ вания триплетных пиков пролин — глутаминовая кислота —