Файл: Новые методы анализа аминокислот, пептидов и белков..pdf
ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 14.10.2024
Просмотров: 128
Скачиваний: 0
х р о м а т о г р а ф и ч е с к и й а н а л и з н а с ф е р и ч е с к и х с м о л а х |
53 |
ионообменными смолами, имеющими гранулы сферической фор мы, а также использование специальных фильтров позволило значительно уменьшить образование пузырьков газа.
Для предотвращения образования плесени в буферные рас творы добавляют в качестве антисептика каприловую кислоту или пентахлорфенол. Однако они не всегда эффективны против широкого класса споровых, поэтому большие количества буфе ров рекомендуется хранить на холоду и лишь одно-двухдиевный запас — при комнатной температуре.
Упомянутые антисептики добавляют к буферам: каприловую кислоту — в количестве 0,1 мл на литр буфера, пентахлорфенол (раствор: 50 мг пентахлорфенола в 10 мл 95%-ного этанола) — в количестве 0,1 мл на литр буфера.
Для предотвращения окисления метионина в пробе во время ввода ее в колонку и в ходе анализа в буферы добавляют тиодигликоль.
Обычно буферные растворы готовят следующим образом (в расчете на 4 л).
1) Навеску цитрата натрия растворяют в 3,5 л воды в пред варительно откалиброванной стеклянной или полиэтиленовой бутыли.
2) При перемешивании добавляют концентрированную соля ную кислоту, антисептик и, в случае необходимости, тиодигликоль. Доводят объем водой до 4 л.
3)Буфер тщательно перемешивают и измеряют температуру.
4)Калибруют pH-метр по стандартному буферу.
5)Проверяют величину pH приготовленного буфера. При
этом разница температур приготовленного и стандартного бу феров не должна превышать 0,5 °С.
6) Если нужно довести pH полученного буфера до нужного значения, следует исходить из расчета, что добавление 0,4 мл конц. НС1 или 0,2 мл 50%-ного раствора NaOH изменяет значе ние pH 0,35 и 0,38 н. буферных растворов на 0,01 единиц pH. Для доведения 0',2 н. буферных растворов требуются в два раза меньшие количества кислоты или щелочи указанной концент рации.
Буфер для растворения пробы. Для растворения пробы ис пользуют 0,2 н. натрийцитратный буфер pH 2,2 (см. табл. 4).
0,3 н. NaOH для регенерации. Растворяют 12,0 г едкого нат ра в достаточном количестве воды и после остывания раствора доводят объем до 1 л.
1.6.3.Нингидриновый реагент
Этот реагент содержит нингидрин, двухлористое олово, метилцеллозольв и 4 н. натрийацетатный буфер. Метилцеллозольв не должен содержать перекисей, поскольку в их присутствии
54 ГЛАВА 1
двухлористое олово ие способно восстанавливать нингидрин до гидрнндантина. Метнлцеллозольв проверяют на присутствие перекисей следующим образом:
Смешивают приблизительно 4 мл метплцеллозольва с равным объемом 4%-ного водного раствора йодистого калия. Если перекисей не содержится, смесь должна остаться бесцветной. При наличии перекисей появляется жел тая окраска.
Приготовление нингидринового реагента. Для приготовления нингидринового реагента рекомендуется использовать стеклян ную бутыль, выкрашенную в черный цвет. При этом полезно оставить на бутыли узкую неокрашенную вертикальную полоску шириной около 1 см, чтобы иметь возможность наблюдать за растворением реактивов в процессе приготовления нингидрино вого реагента и за его расходом при работе анализатора. После приготовления реагента неокрашенную полоску на бутыли сле дует закрыть полоской бумаги или другим подходящим мате риалом, чтобы защитить реагент от света.
1) В подготовленную таким |
образом бутыль помещают 1 л |
4 н. натрийацетатного буфера |
и 3 л метплцеллозольва. (Осто |
рожно! Метнлцеллозольв токсичен. Работать в вытяжном шкафу!) Закрепляют на бутыли пробку с входной и выходной трубками для азота и нингидринового реагента соответственно.
2)К длинной трубке* присоединяют шланг от баллона с азотом и начинают осторожно пропускать через смесь азот со скоростью приблизительно 500 см3/мин. Включают магнитную мешалку.
3)Затем пробку слегка приподнимают и медленно добав ляют 80,0 г нингидрина через насыпную воронку. Продолжают перемешивание до тех пор, пока реактив не растворится. Для ускорения растворения нингидрина рекомендуется медленно по водить бутыль по окружности магнитной мешалки так, чтобы
лучше размешивался нингййрин у стенок на дне бутыли.
4) По окончании растворения к смеси добавляют 1,600 г двухлористого олова. Продолжают перемешивать и пропускать через жидкость азот. В случае попадания нингидрина или дву хлористого олова на горло бутыли или ту часть трубочек, кото рая находится над жидкостью, их смывают небольшими порция ми воды. Вынимают воронку из горла бутыли.
5)Окончательно закрепляют пробку на бутыли.
6)Закрывают соответствующие краны на входе и выходе из бутыли.
Один литр 4 н. натрийацетатного буфера, необходимого для по
лучения нингидринового реагента, готовят следующим образом.
* В ходе анализа через эту трубку отбирают нингидриновый реагент, —
Прим, перев.
х р о м а т о г р а ф и ч е с к и й а н а л и з н а с ф е р и ч е с к и х см о л а х |
55 |
1) К 800 мл деионизированной или дистиллированной воды медленно добавляют 544 г СНзСООЫа-ЗНгО в литровом мерном стакане.
2) Перемешивают при нагревании до полного растворения реактива.
3) Охлаждают до комнатной температуры и добавляют
100 мл ледяной уксусной кислоты.
4)Доводят объем раствора деионизированной или дистилли- ■ рованной водой до 1 л.
5)Величина pH полученного таким образом буфера должна
быть равна 5,50 ± 0,02. Если нужно довести величину pH буфе ра,. исходят из того, что добавление 0,5 г едкого натра изменяет pH такого буфера на 0,02 единицы pH. Для подкисления буфера используют ледяную уксусную кислоту.
При приготовлении описанного выше нингидринового реа гента нам не раз приходилось встречаться с трудностями. Эти трудности обычно приписывались качеству метилцеллозольва. Важно, чтобы метилцеллозольв не только не содержал следов перекисей ( < 3 млн. д.), которые мешают протеканию цветной реакции с нингидрином, но и не вызывал помутнения раствора, как это бывает с некоторыми партиями, после контакта с воз духом (особенно если последний попадает при перемешивании нингидринового реагента). При использовании такого недобро качественного метилцеллюлоза в ходе анализов образуется бе лый осадок, который удерживается на внутренних стенках труб ки реактора и в кюветах колориметра. Этот осадок не похож на гидриндантин, так как он нерастворим в метилцеллозольве, но растворяется в разбавленной кислоте. Для уменьшения образо вания этого осадка после нингидринного насоса помещают спе циальный фильтр.
1.6.4.Методика анализа белковых гидролизатов
По этой методике можно анализировать 20 аминокислот, ко торые описаны в разд. 1.3.1.1. Ниже описаны условия анализа этих аминокислот с использованием смол типа UR-30 и UR-40. На смоле UR-30 анализируются кислые и нейтральные амино кислоты при высоте столбика смолы 56 см. Основные аминокис лоты анализируются на колонке высотой 5,5 см, заполненной смолой РА-35. Общая продолжительность анализа составляет около 4 ч. Время анализа можно сократить до 2 ч путем прове дения анализа одновременно на обеих колонках с точным рас четом момента включения и переключения колонок. На той же колонке, заполненной смолой UR-30, также можно анализиро вать все аминокислоты, включая и основные. Для их элюирова ния используют третий буфер, который подают после разделения кислых и нейтральных аминокислот.
|
НАТРИИЦИТРАТНЫЕ БУФЕРЫ ДЛЯ АНАЛИЗА БЕЛКОВЫХ ГИДРОЛИЗАТОВ |
Таблица 2 |
|||||
|
|
||||||
|
|
|
Четырехчасовой |
метод |
|
Двухчасовой метод |
|
|
|
кислые и нейтральные |
основные |
кислые и нейтральные |
основные |
||
|
|
аминокислоты |
аминокислоты |
аминокислоты |
аминокислоты |
||
|
|
(смола UR-30) |
(смола РА-35) |
«смола UR-30) |
(смола РА-35) |
||
pH |
|
3.25 + 0.01 |
4.30+0,02 |
5,25+0.01 |
3,488+0.005 |
4,404 + 0,010 |
5,359+0,010 |
Концентрация натрия, н. |
0.20 |
0,20 |
0,35 |
0,20 |
0,20 |
0,35 |
|
Концентрация цитрата, |
М |
0,066 |
0,066 |
0,117 |
0,066 |
0,066 |
0,117 |
Цитрат натрия • 2Н;,0, |
г |
78,4 |
78,4 |
137,3 |
78,4 |
78,4 |
137,3 |
Конц. НС], мл |
|
50.3 |
33,1 |
26.2 |
46,8 |
32,3 |
25,6 |
Тиодигликоль 3. мл |
|
40,0 |
40.0 |
— |
40.0 |
40,0 |
___ |
Пентахлорфенол б. мл |
|
0.4 |
0.4 |
0.4 |
0.4 |
0,4 |
0,4 |
Конечный объем, л |
|
4 |
4 |
4 |
4 |
4 |
4 |
|
|
Одноколоночный метод |
Одноколоночный |
метод |
|||
|
|
|
(смола UR-30) |
|
(смола UR-40) |
||
pH |
|
3,28+0.01 |
4.30+0.11 |
6,71+0,01 |
3,545 + 0,01 |
4,250+ 0,02 |
6,71+0,01 |
Концентрация натрия, н. |
0.20 |
0.20 |
1.00 |
0.20 |
0,20 |
1,00 |
|
Концентрация цитрата, |
М |
0,066 |
0.066 |
0.333 |
0.200 |
0.066 |
0,333 |
Цитрат натрия • 2Н20, г |
78,43 |
78,43 |
392,15 |
78.43 |
78,43 |
392.15 |
|
Лимонная кислота, г |
|
— |
— |
— |
112.0 |
___ |
___ |
Конц. НС1, мл |
|
49.3 |
33.0 |
5,0 |
12.0 |
33.5 |
5,0 |
Тиодигликоль3, мл |
|
40.0 |
— |
___ |
20 |
20 |
20 |
Конечный объем, л |
|
4 |
4 |
4 |
4 |
4 |
4 |
3 25Ж-НЫЙ раствор, очищенный («Pierce Chemical Company»!. ® Раствор 50 мг пентахлорфенола в 10 мл 95«-ного этанола.
ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ НА СФЕРИЧЕСКИХ СМОЛАХ |
5? |
Смола UR-30 *. Сульфированный сополимер стирола, имею щий номинально 7,25% сшивки. Сферические частицы смолы имеют в среднем диаметр 23 + 6 мкм.
Реагенты. Состав натрийцитратных буферов приведен в табл. 2. Приготовление нингидринового реагента описано в разд. 1.6.3.
1.6.4.1.Заполнение колонки смолой
Мы приводим общую процедуру заполнения колонки смолой. Ее можно использовать в различных описанных ниже методиках с учетом небольших изменений скорости, величины pH и ионной силы буферов, а также температуры колонки.
Для анализа кислых и нейтральных аминокислот белковых гидролизатов необходима стеклянная колонка размером 69- ■0,9 см, а для основных аминокислот — колонка 23-0,9 см. Реко мендуется следующая процедура.
Перед тем как заполнить колонку смолой, ее нужно тщатель но вымыть. Для этого кусочек подходящей ткани смачивают в детергенте (например, Тритон Х-100 или Brij-35 **) и осторожно протирают ею колонку с помощью палочки так, чтобы не повре дить стенки колонки. Рекомендуется также вымыть нижний фи тинг колонки моющим средством Аякс (Ajax) или другим сход ным с ним очищающим средством. Затем колонку и фитинг про мывают деионизированной водой.
Снизу колонки вставляют фильтр из нержавеющей стали, который вводят дальше с помощью фитинга. Для облегчения ввода фитинга уплотняющее кольцо на нем слегка смачивают водой. Тем не менее должно чувствоваться слабое прогибание фильтра вверх, поскольку он имеет несколько больший диаметр, чем внутренний диаметр колонки. Рубашку колонки помещают таким образом, чтобы фитинг можно было ввести полностью. В конечном счете фильтр должен быть расположен в колонке строго горизонтально***. Если все лее фильтр лежит неровно, его осторожно выдавливают длинной палочкой так', чтобы не по вредить стенок колонки. Для удаления смазки колонку обмы вают 5—10 мл этанола. Затем колонку окончательно промывают деионизированной водой, оставив под конец слой жидкости над
*Смола фирмы «Beckman-Spinco» (Пало-Альто, Калифорния).
**Тритон Х-100 поставляет фирма «Rohm and Haas Company»; Brij-35
распространяют фирмы «Pierce Chemical Company» (Рокфорд, Иллинойс) и' «Atlas Powder Company» (Уилмингтон, Делавэр).
***С целью ровной и плотной посадки фильтра на уплотняющем кольце
фитинга рекомендуется слегка поджать его сверху колонки с помощью ровно обрезанной и оплавленной стеклянной палочки или стержня из нержа веющей стали с наконечником из фторопласта диаметром 8 мм, — Приму перев,