Файл: Новые методы анализа аминокислот, пептидов и белков..pdf

44 ГЛАВА 1

цитруллин уменьшается при увеличении концентрации ионов натрия на 0,01 единиц нормальности.

Кислые и нейтральные аминокислоты, смола UR-30, литий-

цитратные буферы. В общем по мере увеличения концентрации ионов лития время анализа сокращается. При увеличении кон­ центрации Li+ с 0,20 до 0,35 н. глутаминовая кислота элюируется значительно раньше, вплоть до совпадения ее пика с пиком аспа­ рагина. Пролин и глицин не разделяются, а цистин элюируется вместе с валином. Не разделяются также метионин и цистатионин, а р-аланин элюируется вместе с фенилаланином.

Кислые и нейтральные аминокислоты, смола UR-40. Поддер­ живая постоянными температуру колонки, скорость течения бу­ фера и концентрацию цитрат-ионов, варьируют концентрацию ионов натрия в обоих буферах, первом и втором. Обычно умень­ шение концентрации ионов натрия приводит к задержке элюиро­ вания большинства аминокислот; однако большинство заметных эффектов наблюдается здесь при уменьшении концентрации ионов натрия, что позволяет растянуть пики пролина, глутами­ новой кислоты и цитруллина и улучшить разделение изолейцина и лейцина.

Основные аминокислоты, смола UR-40. Так же, как и при анализе кислых и нейтральных аминокислот, уменьшение концен­ трации ионов натрия приводит, как правило, к задержке элюиро­ вания аминокислот. Уменьшение концентрации ниже 0,4 н. ока­ зывает незначительное влияние на разделение этаноламина и ам­ миака, но при этом разделение лизина и 1-метилгистидина умень­ шается до 0,45 (соотношение высот впадины и пика).

Основные аминокислоты, смола РА-35. Увеличение концен­ трации ионов натрия с 0,36 до 0,38 и. практически не влияет на разделение этаноламина и аммиака. Разделение лизина и 1-ме­ тилгистидина улучшается до 0,45.

1.4.5.Влияние концентрации цитрат-ионов

1.4.5.1.Влияние концентрации цитрат-ионов при анализе белковых гидролизатов

Четырехчасовой метод, смола UR-30. При увеличении концен­ трации цитрат-ионов улучшается разделение глицина и аланина.

Двухчасовой метод, смола UR-30. Повышение концентрации цитрата до 0,10 М не влияет на разделение пиков треонин — серин и серин — глутаминовая кислота. Цистин элюируется с пролином, но улучшается разделение глицина и аланина.

Одноколоночный метод, смола UR-30. При постоянных значе­ ниях pH натрийцитратного буфера (pH 3,28) концентрации ионов натрия (0,20 и.), температуры колонки (55,6°С) и скорости

течения буфера (130 мл/ч) изменение концентрации цитрата от 0,066 до 0,100 М не сказывается на разделении треонина и се­ рина. Улучшается разделение глицина и аланина; однако цистин* элюируется быстрее, частично накладываясь на пик аланина.

Одноколоночный метод, смола UR-40. При сохранении по­ стоянными температуры колонки (48°С), концентрации ионов натрия (0,20 н.), величины pH первого буфера (3,545) и скоро­ сти течения буфера (60 мл/ч) увеличение концентрации цитрата с 0,066 до 0,200 М не сказывается на разделении треонина и серина. Значительно улучшается разделение глицина и аланина,

ацистин элюируется из колонки быстрее.

1.4.5.2.Влияние концентрации цитрат-ионов при анализе физиологических жидкостей

Кислые и нейтральные аминокислоты, смола UR-30, литий-

цитратные буферы. При постоянных значениях pH буфера (2,80), температуры колонки (38,8 °С) и скорости течения буфера (70 мл/ч) изменение концентрации цитрата с 0,033 до 0,166 М оказывает такое же общее влияние, что и увеличение pH буфера. При концентрации цитрата 0,033 М оксипролин и аспарагиновая кислота не разделяются, но по мере увеличения концентрации цитрата аспарагиновая кислота элюируется, опережая оксипро­ лин. При концентрации цитрата 0,166 М цистатионин и метионин не разделяются.

Кислые и нейтральные аминокислоты, смола UR-40. Повы­ шение концентрации цитрата с 0,066 до 0,133 М не изменяет по­ ложения глутаминовой кислоты относительно пролина или цитруллина при следующих условиях анализа: pH буфера 3,175, концентрация ионов натрия 0,18 н., температура колонки 32,5°С, скорость течения буфера 60 мл/ч. При увеличении концентрации цитрата улучшается разделение аспарагина и треонина до 0,40 (соотношение высот впадины и пика). При более высокой кон­ центрации цитрата большинство аминокислот элюируются быст­ рее. Значительно улучшается разделение глицина и аланина; сжимаются пики пролина, глутаминовой кислоты и цитруллина.

1.4.6.Влияние температуры

1.4.6.1.Влияние температуры при анализе белковых гидролизатов

Четырехчасовой метод, смола UR-30. При понижении темпе­ ратуры всего на несколько десятых градуса улучшается разделе­ ние треонина и серина. Разделение тирозина и фенилаланина улучшается при повышении температуры. Однако при этом ухуд­ шается разрешение пиков изолейцина и лейцина.

46 ГЛАВА Т

Двухчасовой метод, смола UR-30. При понижении темпера­ туры колонки улучшается разделение треонина н серина, а так­ же серина и глутаминовой кислоты. Цистин вымывается позднее и может элюироваться вместе с глицином. Но понижение темпе­ ратуры способствует лучшему разделению пар аминокислот гли­ цин— аланин и изолейцин — лейцин. При повышении темпера­ туры улучшается разделение тирозина и фенилаланина.

Одноколоночный метод, смола UR-30. Повышение темпера­ туры колонки с 52 .до 55,6 °С при постоянных значениях pH бу­ фера, его концентрации и скорости приводит в общем к увеличе­ нию скорости элюирования аминокислот. Подвижность орнитина и лизина мало меняется с температурой. Аргинин элюируется быстрее, и, кроме того, улучшается разделение пар треонин — серин и тирозин — фенилаланин.

Одноколоночный метод, смола UR-40. Повышение темпера­ туры колонки с 48,0 до 50,0 °С при постоянных значениях pH бу­ фера, его концентрации и скорости течения приводит в основном к увеличению скорости элюирования аминокислот. Разделение треонина и серина уменьшается приблизительно до 0,01 (соотно­ шение высот впадины и пика), а серина и глутаминовой кис­ лоты— до 0,17. Подвижность цистина мало меняется с темпера­ турой, однако разделение пар глицин — аланин и тирозин — фенилаланин улучшается соответственно до 0,14 и 0,08. Из ос­ новных аминокислот только аргинин элюируется быстрее при повышении температуры.

1.4.6.2.Влияние температуры при анализе физиологических жидкостей

Кислые и нейтральные аминокислоты, смола UR-30, натрий-

Цитратные буферы. По мере повышения температуры улучшает­ ся разделение а-аминоадипиновой и сс-амино-н-масляной кислот, но ухудшается разделение валина и цистина. Повышение темпе­ ратуры способствует также более полному разделению следую­ щих пар аминокислот: аспарагиновая кислота—треонин и тиро­ зин — фенилаланин. При повышении температуры цистин, как и глутаминовая кислота, элюируется из колонки значительно бы­ стрее. Триплет пиков пролин — глутаминовая кислота — цитруллин сжимается, в результате чего ухудшается разделение этих аминокислот.

Кислые и нейтральные аминокислоты, смола UR-30, литий-

цитратные буферы. Повышение температуры колонки в общем приводит к ускорению элюирования аминокислот. При 30 °С раз­ деление пролина и а-аминоадипиновой кислоты неполное. При повышении температуры ухудшается разделение цистатионина и метионина; однако разрешение пиков цитруллина и а-амино-н-

масляной кислоты, а также пролина и а-аминоадипиновой кис­ лоты улучшается.

Кислые и нейтральные аминокислоты, смола UR-40. Повыше­ ние температуры колонки приблизительно на 1,5°С при неизмен­ ных значениях pH буфера, концентрации ионов натрия и цитратионов, а также скорости подачи буфера приводит в основном к ускорению элюирования аминокислот. Разделение аспарагиновой кислоты и треонина улучшается приблизительно до 0,12. Однако глутаминовая кислота элюируется настолько быстро, что не пол­ ностью разделяется с пролином. Цистин вымывается быстрее на 2 мин, а пролин — глутаминовая кислота — цитруллин выхо­ дят более узкой зоной и поэтому разделяются хуже. При повы­ шении температуры значительно улучшается разделение тиро­ зина и фенилаланина, но несколько ухудшается разделение изолейцина и лейцина.

Основные аминокислоты, смола типа UR-40. Слабое измене­ ние температуры колонки влияет на подвижность аргинина, карнозина и триптофана. Повышение температуры влечет за собой более быстрое элюирование всех аминокислот. При повышении температуры на 3°С улучшается разделение этаноламина и ам­ миака (но ухудшается разделение лизина и 1-метилгистидина). Кроме того, а-аминомасляная кислота элюируется быстрее, чем другие аминокислоты; улучшается разделение оксилизина и алло-оксилизина. Наиболее трудным в этом анализе является разделение а-амино-н-масляной кислоты и орнитина, этанол­ амина и аммиака, лизина и 1-метилгистидина.

Основные аминокислоты, смола РА-35. Повышение темпера­ туры ускоряет элюирование аргинина и карнозина. Если темпе­ ратура слишком высока, триптофан вымывается вместе с ансерином.

1.5.РАСЧЕТ ПЛОЩАДЕЙ ПИКОВ

1.5.1.Разрешение пиков

Основные методы ручного обсчета пиков аминокислот приме­ нимы только в тех случаях, когда симметрия пика приближается к гауссовой форме. Любое отклонение от этой симметрии — вследствие перекрывания или слабого перекашивания пиков — приводит к ошибке. В общем точность определения количества вещества, содержащегося в вытекающем из колонки эффлюенте, зависит от формы и площади пика. Многие факторы влияют на форму пика; эти факторы обсуждались в разд. 1.4. Показатель разрешающей способности или разделения хроматографических пиков может быть выражен как отношение высоты впадины к рысоте пика.

Если два пика, приблизительно одинаковые по высоте, нахо­ дятся рядом друг с другом так, что впадина между ними ие ка­ сается фоновой линии, то отношение высоты впадины к высоте пика будет а:б, где «а» представляет собой величину оптической плотности в точке минимума впадины, а «б» — величину оптиче­ ской плотности, соответствующую точке максимума меньшего из двух пиков. При измерении величин оптической плотности впа­ дины и пика необходимо вносить поправку на нулевую линию по хроматограмме. Для получения достоверных результатов ре­ комендуется подсчитывать площадь таких пиков, которые имеют величину отношения высоты впадины к высоте пика, не превы­ шающую 0,40.

1.5.2.Определение концентрации пробы

Количество каждой аминокислоты в пробе обычно определя­ ется путем измерения площади пика этой аминокислоты на хро­ матограмме.

В большинстве случаев площади хроматографического пика можно с достаточным приближением рассчитать, измерив высоту пика и умножив эту величину на ширину пика на уровне поло­ вины высоты. Высоту (Я) пика в единицах оптической плотно­ сти определяют по диаграммной бумаге самописца за вычетом величины оптической плотности, соответствующей фоновой ли­ нии. При использовании многоточечного самописца число точек на кривой выше уровня половины высоты пика представляет со­ бой ширину (W) пика в единицах времени. Тогда H-W/C, где С — концентрация аминокислоты в микромолях, представляет со­ бой константу, получаемую при калибровке прибора с помощью аминокислот известной концентрации.

Сравнительная оценка семи методов определения площадей хроматографических кривых была дана Меффердом с сотр. [141].

Харрис и Хабгуд [142] показали, что точность определения площади хроматографического пика по вышеописанному методу возрастает, если высота и ширина пика имеют большую абсолют­ ную величину. Общее обсуждение интегрирования пиков было проведено Темпе [143]. Экспериментальная оценка неопределен­ ных ошибок при измерении хроматографических пиков широко представлена в работах Балла, Харриса и Хабгуда [144—145]. Обычными источниками ошибок являются неправильное опреде­ ление фоновой линии, ошибка в измерении высоты пика от фо­ новой линии, неправильная отметка уровня половины высоты и, наконец, ошибка в измерении ширины пика. Было найдено, что для пиков данной высоты ошибки уменьшаются по мере того, как ширина увеличивается вплоть до предельной величины— 3—4 см. Кроме того, для уменьшения ошибок пик должен быть