Файл: Новые методы анализа аминокислот, пептидов и белков..pdf
ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 14.10.2024
Просмотров: 131
Скачиваний: 0
|
|
|
|
|
|
|
|
Таблица За |
|
НАТРИИЦИТРАТМЫЕ БУФЕРЫ ДЛЯ АНАЛИЗА ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЕЙ |
|
||||||||
|
|
|
11-часовой метод |
|
|
6-часовой |
метод |
|
|
|
|
кислые и нейтральные |
основные аминокислоты |
кислы е и нейтральны е |
основные |
аминокислоты |
|||
|
|
аминокислоты |
аминокислоты |
||||||
|
|
(смола UR-30) |
(смола РА-35) |
(смола UR-40) |
(смола UR-4Q) |
||||
pH |
|
3,20+0,01 |
4,26+0.02 |
4.25+0.01 |
5,36+0,01 |
3,175+0.01 |
4,243+0.01 |
4.148 + 0.01 5,000+0.01 |
|
Концентрация натрия, |
н |
0,20 |
0,20 |
0,38 |
0,35 |
0,18 |
0.18 |
0,40 |
0,40 |
Концентрация цитрата, М |
0,066 |
0.066 |
0.127 |
0.117 |
0.133 |
0,060 |
0,133 |
0,133 |
|
Цитрат натрия ■ 2Н20, |
г |
78,4 |
78,4 |
149,0 |
137,3 |
70,56 |
70,56 |
156,9 |
156,9 |
Лимонная кислота, г |
|
— |
— |
— |
— |
61,6 |
— |
— |
— |
Конц. НС1, мл |
|
51,1 |
33,5 |
61,0 |
25.6 |
35.0 |
29,0 |
65,0 |
60.0 |
Тиодигликоль а, мл |
|
40,0 |
40.0 |
— |
— |
20,0 |
20 |
— |
— |
Пентахлорфенол 6 |
|
0,4 |
0.4 |
0,4 |
0,4 |
— |
— |
— |
— |
Конечный объем, л |
|
4 |
4 |
4 |
4 |
4 |
4 |
4 |
4 |
Л25%-ный раствор, очищенный («Pierce Chemical Company»).
Раствор 50 мг пентахлорфенола в 10 мл 95%-ного этанола.
со
р-Аминоизомасляная кислота
Рис. 3. Анализ синтетической смеси аминокислот и родственных соединений на колонке высотой 56 см со смолой UR-30 при использовании литийцитратных буферов для кислых и нейтральных аминокислот.
Все аминокислоты анализировались в количестве 0,100 мкмоль, за исключением следующих (в мкмоль): фосфосерин, таурин, фосфоэтаноламнн, саркозии и цистатионнн по 0,065; глутамин 0,145; цитруллнн 0,030; а-аминоадипиновая кислота 0,030; а-амино-н-масляная кислота 0,035; норлейцин 0,120; 3-аминоизомасляная кислота 0,130.
(36 |
ГЛАВА I |
непростую задачу. Для анализа этих двух аминокислот были описаны методы с программированием температуры [151], а так же ферментативные методы. Определение одного аспарагина в плазме крови разработал Барри [153]. Мур и Стейн [2] лишь упоминали о возможности использования литийцитратных бу феров в ионообменной хроматографии. Бенсон с сотр. [150], ос новываясь на работе Мура и Стейна, разработал методику ана лиза глутамина и аспарагина в присутствии других аминокислот.
Считают, что различие в разделении аминокислот при исполь зовании литийили натрийцитратных буферов обусловлено, повидимому, гидратацией. Хефтман [29] объясняет, что скорость ионного обмена в первую очередь контролируется процессом диффузии ионов из смолы и что наименее прочно связываются наиболее гидратированные ионы. Гидратированный ион лития имеет 7,3—10,0 А в диаметре, тогда как ион натрия—5,6—7,9 А. При использовании смолы UR-30 продолжительность анализа кислых и нейтральных аминокислот физиологических жидкостей составляет 270 мин, включая определение (3-аминоизомасляной кислоты.
Заполнение колонки. Вначале смолу переводят из натриевой формы в литиевую. Для этого смолу помещают на воронку Бюхнера и промывают десятью объемами 2%-ной гидроокиси лития, затем десятью объемами деионизированной воды и окон чательно десятью объемами стартового буфера. После этого смолу оставляют на ночь в стартовом литийцитратном буфере, чтобы полностью перевести ее в литиевую форму.
Таблица 36
ЛИТИПЦИТ РАТНЫЕ БУФЕРЫ ДЛЯ АНАЛИЗА КИСЛЫХ И НЕЙТРАЛЬНЫХ АМИНОКИСЛОТ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЕЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СМОЛЫ UR-30
pH |
,80±0,01 |
4,16±0,01 |
Концентрация ионов лития, и. |
0,30 |
0,30 |
Концентрация цитрата, М |
0,053 |
0,033 |
Цитрат лития • 4Н20, г |
60.2 |
37.6 |
Хлористый литий, г |
23,8 |
33,9 |
Тиодигликоль а, мл |
40 |
40 |
Конц. HCI, мл |
47.0 |
19,0 |
Конечный объем, л |
4 |
4 |
25 К-НЫЙ раствор, очищенный («Pierce Chemical Company»).
Колонку размером 69-0,9 см заполняют смолой до высоты
56 см |
в буфере с pH 2,80 |
(0,3 н. Li+, 0,053 М цитрат) |
при ско |
||
рости |
70 мл/ч |
(см. разд. |
1.6.4) и температуре рубашки |
38,8 °С. |
|
По окончании |
заполнения |
колонку регенерируют 0,3 |
н. |
гидро |
|
х р о м а т о г р а ф и ч е с к и й а н а л и з н а с ф е р и ч е с к и х СМОЛАХ |
67 |
окисью лития и уравновешивают в течение 1 ч стартовым бу фером.
Режим анализа следующий: скорость подачи буфера 70 мл/ч, нингидрина — 35 мл/ч; температура колонки 38,8 °С. Через 137 мин после начала анализа стартовый 0,3 н. литийцитратный буфер (0,053 М по цитрату) с pH 2,80 заменяют на 0,3 н. литий цитратный буфер с pH 4,16 (0,033 М по цитрату). Температура колонки в течение всего анализа не меняется; давление состав ляет около 5,8 атм. На рис. 3 показаны результаты деления аминокислот, полученные по этой методике. Состав литийцитратных буферов приведен в табл. 36.
1.6.5.2.Анализ с использованием смолы UR-40
Колонка заполняется этой смолой до высоты 26 см, как опи сано в разд. 1.6.4. Для заполнения используют 0,18 н. натрийцитратный буфер с pH 3,175 (0,133 М по цитрату), не содержа щий детергента (см. табл. За).
Кислые и нейтральные аминокислоты. Скорость подачи бу фера (60 мл/ч) и скорость подачи нингидринового реагента (30 мл/ч) поддерживают в течение всего анализа постоянными. Анализ начинают при 32,5°С. Через 66 мин температуру в ру башке колонки постепенно, в течение 20 мин, повышают до 60°С. Через 80 мин с момента начала анализа 0,18 н. натрийцитратный буфер с pH 3,175 (0,133 М по цитрату) заменяют на 0,18 н. натрийцитратный буфер с pH 4,243. Скорость диаграмм ной бумаги 15 см/ч; диапазон шкалы самописца 0—5 мВ. Дав ление на колонке 15,8 атм, продолжительность анализа 170 мин.
На рис. 4 представлена хроматограмма анализа, полученная по этой методике. Анализ выполнен при объеме реактора 11,25 мл (время цветной реакции 7,5 мин) и длине кювет, равной 6,6 мм (для длины волны 570 и 440 нм).
Основные аминокислоты. На этой же колонке при тех же ско ростях подачи буфера и нингидринового реагента можно анали зировать и основные аминокислоты. Анализ начинают при тем пературе 32,5 °С, которую через 33 мин постепенно, в течение 20 мин, повышают до 60 °С. В качестве стартового буфера ис пользуют 0,40 н. натрийцитратный буфер с pH 4,148. На 190-й минуте с момента начала анализа его заменяют 0,40 н. натрийцитратным буфером с pH 5,000 (см. табл. За). Рабочее давление на колонке равно 15,8 атм (при 32,5 °С), продолжительность ана лиза составляет 300 мин. Анализ можно ускорить до 210 мин, если скорость элюирования увеличить до 80 мл/ч (скорость по дачи нингидринового реагента 40 мл/ч) и соответственно изме нить время переключения температуры и буферов. Давление на колонке в этом случае составит 19,7 атм. Таким образом на
8*
р-Аминоизомасляная кислота
Рис. 4. Анализ калибровочной смеси аминокислот и родственных соединений по методике анализа физиологиче ских жидкостей на колонке высотой 26 см со сферической смолой UR-40. (Концентрации аминокислот те же, что и на рис. 3.)
A rg
Рис. 5. Анализ синтетической смеси основных аминокислот и родственных соединений на колонке высотой 26 см со смолой UR-40 при использовании натрийцитратных буферов.
Все аминокислоты анализировались в количестве 0,100 мкмоль, за исключением ансернна (0,060 мкмоль) и карнозина (0,110 мкмоль).
70 ГЛАВА Т
полный анализ всех аминокислот физиологических жидкостей потребуется немногим более 6 ч.
На рис. 5 показана хроматограмма разделения синтетичес кой смеси основных аминокислот.
1.6.6.Ускоренный одноколоночный метод анализа белковых гидролизатов
Помимо ускоренного анализа кислых, нейтральных и основ ных аминокислот, проводимого на двух колонках, использова ние смол UR-30 и UR-40 дает возможность 1) анализировать на одной колонке кислые, нейтральные и основные аминокислоты в ускоренном режиме; 2) выполнять анализы при меньшем дав лении, чем при использовании ранее описанных смол в одинако вых условиях; 3) улучшить разделение аминокислот.
1.6.6.1.Одноколоночный анализ с использованием смолы UR-30
Колонку заполняют смолой до высоты 56 см. Анализ прово дят по следующему режиму. Скорость подачи буфера и нингидринового реагента равна соответственно 130 и 65 мл/ч. Анализ начинают с элюирования 0,20 н. натрийцитратным буфером pH 3,28 ±0,02, который через 37 мин заменяют на 0,20 н. натрийцитратный буфер с pH 4,30 ± 0,02. Начальная температура ко лонки 55,6°С. Через 42 мин температуру постепенно повышают до 64,8°С (в течение 55—60 мин). На 54-й минуте производят за мену на третий буфер (1,0 н. цитрат натрия, pH 6,71) для элюи рования основных аминокислот. Рабочее давление в конце ана лиза 29,9 кгс/см2, продолжительность анализа 150 мин (рис. 6). Состав буферов приведен в табл. 2.
Обсуждение. По этой простой методике анализа белковых гидролизатов можно определять 23 соединения, включая обыч ные аминокислоты. Однако если эти аминокислоты содержатся в физиологических жидкостях, таких, как плазма крови, моча, гомогенаты тканей, то для полного анализа требуется более сложная методика. При одноколоночном методе анализа отпа дает необходимость регенерации колонки * и уравновешивания смолы буфером.
При анализе плазмы по этой методике цитруллин элюируется вместе с пролином, а аспарагин и глутамин вымываются вместе с серином. Содержание глутамина и аспарагина можно опреде лить после проведения кислотного гидролиза.
* Без регенерации щелочью на колонке могут задерживаться пептиды и продукты деструкции некоторых аминокислот,-образующиеся при кислотном гидролизе белков. Эти продукты могут исказить последующие анализы. —
Прим, перев.
Рис. 6. Анализ синтетической смеси аминокислот и родственных соединений на сферической смоле UR-30.
Все аминокислоты анализировались в количестве 0,125 мкмоль, за исключением (в мкмоль): таурин 0,085; мочевина 0,300; о-амино-к- масляная кислота 0,028; триптофан 0,216.