Файл: Новые методы анализа аминокислот, пептидов и белков..pdf

1.6.6.2.Одноколоночный анализ с использованием смолы UR-40

Для одноколоночного хроматографического анализа кислых, нейтральных и основных аминокислот белковых гидролизатов используется такая же колонка высотой 26 см, которая была описана применительно к более сложному анализу физиологи­ ческих жидкостей (см. разд. 1.6.5). При использовании трех натрийцитратных буферов весь анализ занимает 170 мин. Опи­ санный ниже метод с применением трех буферов позволяет про­ водить весь анализ при одной температуре. Однако можно осу­ ществить анализ белковых гидролизатов, используя вначале ме­ тодику анализа для кислых и нейтральных аминокислот физио­ логических жидкостей (см. разд. 1.6.5.2) и вводя затем третий буфер (сходный с тем, который описан ниже) для элюирования основных аминокислот. Эта методика дает возможность опре­ делять не только обычные аминокислоты, содержащиеся в бел­ ковых гидролизатах, но также и необычные или неизвестные аминокислоты при минимальном перекрывании пиков.

Анализ проводят по следующему режиму. Температура в ко­ лонке 48,0 °С поддерживается постоянной в ходе всего анализа. Скорость подачи буферов и нингидринового реагента равна со­ ответственно 60 и 30 мл/ч. Элюирование начинают с 0,20 н. натрийцитратным буфером pH 3,545 (0,20 М по цитрату), который меняют на второй 0,20 н. натрийцитратный буфер с pH 4,250 так,

чтобы его «выход» на хроматограмме был сразу после фенил­ аланина. Этим буфером элюируют гистидин, лизин, аммиак и аргинин.

Обсуждение. Порядок выхода аминокислот на этой колонке такой же, как и на длинной колонке, заполненной смолой UR-30 (см. рис. 6), с той лишь разницей, что содержащиеся в пробе цистеиновая кислота, таурин и мочевина будут элюироваться не­ сколько раньше. При использовании колонки (26 см), заполнен­ ной смолой UR-40, величина отношения высоты впадины между пиками'к высоте большего пика пары разделяемых аминокислот равна: для пары треонин-серин 0,40, серин — глутаминовая кис­ лота 0,23, глицин — аланин 0,10 и тирозин — фенилаланин 0,16. В условиях данного анализа цистин выходит между пролином и глицином, а гистидин — до лизина. После лизина вымываются аммиак и аргинин. Состав буферов приведен в табл. 2.

1.6.7.Анализ отдельных аминокислот

Повышенный интерес к клиническим исследованиям заболе­ ваний, связанных с нарушениями метаболизма аминокислот, вы­ звал необходимость применения техники быстрого хроматогра-

Рис. 7. Анализ аминокислот, связанных со специфическими аминоацидопатиями, по методике В на колонке высотой 23 см, заполненной смолой РА-35.

А—синтетическая сМесь, содержащая 0,025 мкмоль каждой аминокислоты (использо­ вался самописец со шкалой 4—5 мВ); в—анализ 0.20 мл плазмы здорового человека.

фического анализа отдельных аминокислот, позволяющих диаг­ ностировать специфические нарушения обмена. Для этих целей была разработана техника анализа, которая дает возможность получать не полные хроматограммы, а лишь отдельные ее об­ ласти, представляющие интерес для исследований. При этом ис­ пользуется колонка, заполненная смолой РА-35 до высоты 23 см. Такая колонка применяется также и для определения основных аминокислот. По методу анализа, который первоначально был описан Скрайвером и Дэвисом [69], проба делится на три части, каждая из которых анализируется по одной из'трех описанных ниже методик. Во всех трех методах используется реактор оди­ наковой длины, а буфер и нингидриновый реагент подаются с одинаковой скоростью — соответственно 90 и 45 мл/ч.

Методика А. По этой методике можно определить менее чем за 60 мин следующие аминокислоты: аспарагиновую, глутами­ новую, пролин, глицин, аланин, цистин и валин. Для этой цели используется 0,20 н. натрийцитратный буфер с pH 3,270 (см.

рис. 6).

0,6

0,5

to

£

0,4

bD 0,3

i-Э

0,2

0,1

А —синтетическая смесь, содержащая по 0,020 мкмоль каждой аминокислоты; Б —анализ 0,40 мл плазмы крови здорового человека; В —анализ 0,05 мл плазмы крови больного, страдающего феинлкетонурией.

Методика В. С помощью 0,35 н. натрийцитратного буфера pH 3,165 по этой методике можно определить примерно за 70 мин такие аминокислоты, как пролин, валин, метионин, алло-изолей­ цин, изолейдин и лейцин (рис. 7), содержание которых косвенно связано с лейцинозом, гомоцистинурией, гиперпролинемией. и другими заболеваниями.

Методика С. Эта методика предназначена для анализа ами­ нокислот при таких патологических состояниях, как фенилкетонурия, тирозиноз и гистидинемия. В качестве элюента исполь­ зуют 0,35 н. натрийцитратный буфер с pH 6,46. При этом тиро-

Таблица 4

НДТРИИЦИТРАТНЫЕ БУФЕРЫ ДЛЯ АНАЛИЗА ОТДЕЛЬНЫХ АМИНОКИСЛОТ ПО МЕТОДИКАМ А. В, С И ВР (СМ. РАЗД. 1.6.7)

76 ГЛАВА I

Многие из заболеваний, связанные с нарушением метаболиз­ ма аминокислот, характеризуются прежде всего отклонениями в содержании одной из групп аминокислот. Имея методики ана­ лиза на отдельные группы аминокислот, можно значительно уве­ личить число анализов за рабочий день. (Состав буферов прове­ ден в табл. 4.)

Методика ВР. Эта методика ускоренного анализа позволяет определять все основные аминокислоты, обычно обнаруживае­ мые в физиологических жидкостях. Ее рекомендуется использо­ вать для количественного определения аминокислот при таких патологических состояниях, как болезнь Вильсона, цитруллинемия, псориаз, а также для определения алиментарных колеба­ ний уровня аминокислот. Анализ проводят по следующему ре­ жиму. Буфер и нингидриновый реагент подают со скоростью соответственно 90 и 45 мл/ч. Анализ начинают с 0,38 н. натрийцитратным буфером pH 4,263 при температуре колонки 33,0 °С. Через 125 мин температуру повышают до 55,0 °С и заменяют буфер — на 0,35 н. натрийцитратный с pH 5,360. Продолжитель­ ность анализа 240 мин.

1.6.8.Соединения, содержащие селен

Поскольку селен и его органические производные играют важную роль в биохимических реакциях, возникла необходи­ мость в разработке метода ускоренного количественного анализа селеноцистина и селенометионина [158—161].

Таблица 5

НАТРИ ИЦИТРАТЫ ЫП БУФЕР ДЛЯ АНАЛИЗА СЕЛЕНОСОДЕРЖАЩИХ АМИНОКИСЛОТ

Для анализа этих соединений используют колонку, заполнен­ ную смолой РА-35 до высоты 23 см. Колонку заполняют, как описано в разд. 1.6.4, при скорости буфера 70 мл/ч и темпера­ туре колонки 30°С. Анализ проводят при постоянной темпера­ туре (30 °С) с одним буфером (табл. 5) при постоянной скорости его подачи. Селеноцистин анализируется за 45 мин, а селенометионин — за 90 мин.

Рис. 9. Анализ синтетической смеси аминокислот, включая селеноцистин и селенометионин, на колонке высотой 23 см со смолой типа РА-35.

На рис. 9 показана кривая анализа селеноцистина и селенометионина в присутствии других аминокислот. Анализ выполнен при скорости подачи буфера и нингидринового реагента соответ­ ственно 70 и 35 мл/ч. В течение всего анализа температура ко­ лонки была равна 30 °С, а давление — 23,2атм. Проба содержала по 0,1 мкмоль каждой аминокислоты; результаты анализа реги­ стрировались самописцем со шкалой на 4,5—5,0 мВ.

1.6.9.Методика разделения смесей пептидов

Заключительная часть этой главы посвящена методам деле­ ния пептидов. В соответствии с традиционными методами смесь пептидов, особенно больших, разделяют на смолах с низкой сшивкой. Пье [154] на колонке со смолой дауэкс 1-Х2 при низкой скорости элюирования разделил пептиды, содержащие более 100 аминокислотных остатков. Мур и Стейн [5] при изучении разде­ ления пептидов на сульфированных катионообменных смолах пришли к выводу, что для больших пептидов предпочтительнее смола с 2% сшивки, чем смолы с 4 и 8% сшивки. При использо­ вании низкосшитых смол пептиды элюируются относительно узкими зонами. Однако такие смолы имеют недостаток: они сжи­ маются при изменении концентрации буферов. Усадка смолы сопровождается обычно повышением давления на колонке. В та­ ких случаях перед проведением следующего анализа приходится, как правило, заполнять колонку смолой заново.