Файл: Новые методы анализа аминокислот, пептидов и белков..pdf
ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 14.10.2024
Просмотров: 140
Скачиваний: 0
84 |
ГЛАВА Т |
142.Харрис В., Хэбгуд Г., Газовая хроматография с программированием тем пературы, «Мир», М., 1968.
143.Тетрё J., J. Chromatog., 24, 169 (1966).
144. |
Ball |
D. |
L., Harris |
IF.E., |
Habgood |
H. |
W., Anal. |
Chem., 40, |
129 (1968). |
||
145. |
Ball |
D. |
L„ Harris |
117. |
£., |
Habgood |
H. |
117., Separ. |
Sci., 2, |
81 |
(1967). |
146. |
Gerling |
G. W., Gigg |
A. |
R„ Heley |
M. |
R., J. Chromatog., |
31, 525 (1967). |
||||
147.Mondino A., J. Chromatog., 30, 100 (1967).
148.Schroeder W. A., Holmquist W. R., Shelton J. R„ Anal. Chem., 38, 1281 (1966).
149.Walsh K. A., Brown J. R., Biochim. Biophys. Acta, 58, 596 (1962).
150. Benson J. V., Jr., Gordon M. J., Patterson J. A., Anal. Biochem., 18, 228
S |
. |
|
?s I., Cantor F., Kupfer S., Anal. Chem., 37, 1720 (1965). |
152.Ramadan A., Mohyi El-Din A., Greenberg D. M., Anal. Biochem., 6, 144 (1963).
153.Barry J. M., Nature, 171, 1123 (1953),
154.Piez K. A., Saroff H. A., in «Chromatography», Ed. by E. Heftmann, Reinhold Publishing Corp., New York, 1961, p. 347.
155.Chertioff A. /., Pettit N., Jr., Biochim. Biophys. Acta, 97, 47 (1965).
156.Tallan H. H„ Stein W. H„ J. Biol. Chem., 200, 507 (1953).
157.Block R. M., Ling N„ Anal. Chem., 26, 1543 (1954).
158.Jauregui-Adell J., Advan. Protein Chem., 21, 387 (1966).
159.Rosenfeld /., Beath O. A., Selenium, Academic Press, New York, 1964
160.Schwarz K., Foltz С. M., J. Am. Chem. Soc., 79, 3292 (1957).
161.Math О. H., Selenium in Biomedicine, Connecticut, The AVI Publishing Company, Inc., Westport, 1967.
Г Л А В А 2
Газовая хроматография аминокислот
Дж. Р. Коултер. К. С. Ханн
2.1.ВВЕДЕНИЕ
Слово «белок» (греч. proteios — первый, первичный) впервые было использовано Берцелиусом в 1838 г., и с тех пор изучение структуры и функций белка находится на переднем крае био химических исследований. Период выделения чистых аминокис лот охватывает 132 года — с 1806 г. (цистин) по 1938 г. (оксилизин); и за это время было разработано много новых и изящных методов их выделения и разделения.
Поскольку первым шагом в выяснении строения белка является количественная оценка в гидролизате приблизительно 20 аминокислот, многие крупнейшие авторитеты в белковой хи мии уделяли значительное внимание методам, направленным на достижение этой цели. Так, Фишер [38] первым применил анали тический прием, во многом похожий на современные газохрома тографические методы, превратив аминокислоты в их этиловые эфиры и разделив последние фракционной перегонкой. Хромато графические методы впервые были использованы в 1941 г., когда Мартин и Синдж [86] разделили N-ацетильные производные пролина, валина, фенилаланина, изолейцина и норлейцина на колонке с силикагелем, элюируемой хлороформом. Начиная с 1949 г. в этой области начали появляться работы Мура и Стейна [119], которые предложили элюирование с колонок с крахма лом, а в 1954 г. разработали жидкостное разделение на колон ках с дауэксом-50 в качестве ионообменного адсорбента; они установили таким образом эталон для всех последующих коли чественных аминокислотных анализов [90]. В- 1958 г. вместе со Шпакманом они разработали автоматический прибор, основан ный на использовании их метода, и с тех пор практически все количественные анализы смесей аминокислот выполнялись на приборах этого типа [91] (см. гл. 1 этой книги).
Такая система разделения основана на амфотерном харак тере аминокислот, которые связываются со смолой или отде ляются от нее в условиях, контролируемых градиентом pH, ион ной силой и температурой. Детектирование осуществляется
86 ГЛАВА 2
спектрофотометрически после реакции вытекающей жидкости с нингидрином, количественная оценка проводится измерением площади пиков вручную или электронными методами. Измере ние 10-9 моля примерно за 1 ч (анализатор Техникой TMS 1) яв ляется лучшим в настоящее время результатом, и именно с этим достижением нужно сравнивать все газохроматографические ме тоды. Предпочтение следует отдать тому методу, который ока жется более быстрым или более чувствительным (или же удов летворяет обоим этим условиям), так как число белков, которые еще предстоит анализировать, очень велико. Кроме того, многие белки очень лабильны или с трудом поддаются очистке, вслед ствие чего они доступны только в малых количествах. Мы по лагаем, что ГХ * уже продемонстрировала достаточное превос ходство над анализом на смоле, для того чтобы вытеснить по следний метод во многих случаях.
По сравнению с анализом на смоле газовая хроматография имеет четыре преимущества: (1) газовые хроматографы, снаб женные пламенно-ионизационными детекторами, могут опреде лять такие малые количества вещества, как 10-12 моля, а в со единении с масс-спектрометром— 10-17 моля. Оба эти детектора можно использовать для контроля вытекающей со смолы жид кости, однако в газовом хроматографе они уже являются его составной частью; (2) время анализа сведено к получасу и мо жет быть уменьшено до 10 мин; (3) возможно снижение стои мости оборудования на 50%; (4) газовый хроматограф исполь зуют для других веществ, если он больше не требуется для ами нокислотного анализа.
В последнее десятилетие во многих работах, исчерпывающих или рудиментарных, предпринимались попытки аминокислотного анализа методом ГХ. Взятые вместе, эти публикации не только свидетельствуют о теоретическом превосходстве аминокислот ного анализа методом ГХ, но позволяют также надеяться, что в ближайшее время будет разработан и принят универсальный метод анализа. Станет ли какой-то из уже описанных наиболее
обещающих методов широко |
распространенным, покажет |
время. |
собой не гомологический ряд |
Аминокислоты представляют |
со сходными физическими и химическими свойствами, а разно родную группу алифатических и циклических соединений, имею щих (кроме а-амино- и карбоксильной групп, общих для всех членов ряда) такие различные функциональные группы, как до полнительные карбоксильная и аминогруппа, а также имино-, окси-, сульфгидрильная, имидазольная, гуанидиновая и индоль-
* Сокращения см. в разд. 2.6. Обоснование выбора термина ГХ, а не ГЖХ см. в разд. 2.4.77.
ГАЗОВАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ АМИНОКИСЛОТ |
87 |
ная группы. Эти полярные группировки объясняют высокие тем пературы кипения аминокислот. Возможно, в будущем с появле нием очень чувствительных детекторов наступит практическая возможность разделения и количественного определения натив ных аминокислот методом газовой хроматографии. В настоящее время полярные группы нужно блокировать или удалять; пре вращение в производное должно быть быстрым и четким, с вы ходом, составляющим если и не 100%, то по крайней мере по стоянную величину. Желательно также, чтобы реакция превра щения в соответствующее производное была достаточно специ фичной, чтобы не превращать посторонние соединения в летучие, мешающие ходу анализа вещества. Кроме того, для полного использования присущей ГХ чувствительности методика получе ния производного должна позволять работать с количеством аминокислоты, меньшим чем 10-9 моля. Такое количество веще ства часто невозможно увидеть, поэтому следует избегать необ ходимости переносить его из одного сосуда в другой, сопрово ждающейся возможными потерями. Следовательно, получение производного должно проводиться в одном сосуде. Кроме того, необходимо, чтобы выбранные условия реакции подходили для всех аминокислот. Удобно, если возможен анализ смеси в ходе одного газохроматографического опыта.
Применение газовой хроматографии для аминокислотного анализа лимитировалось несколькими факторами. В литературе можно найти много методов, явно удовлетворительных в руках их авторов, которые оказалось трудно или невозможно воспро извести в любой другой лаборатории. Хорошей хроматографи ческой методике свойствен выбор и проверка произвольных величин для ряда взаимосвязанных переменных — носителей, жидких фаз, температур и т. д. Если принять во внимание до полнительные переменные, связанные с выбором производных и метода синтеза, то неудивительно, что множество работ имеет мало общих точек соприкосновения и в каждой из этих работ говорится о каких-либо улучшениях или преимуществах. На этом основании доверие к ГХ как практическому методу опреде ления аминокислот поколебалось. Те же особенности усложняли и написание обзора литературы, так как многоразмерная мат рица, определяемая всеми переменными, ни в коей мере не яв лялась полностью исследованной. Часто объяснение, выдвигае мое в одной работе, нельзя подтвердить ссылкой на другую. Например, производные, полученные в процессе А, анализи руются одним исследователем на колонке типа X, и при этом пик аргинина не обнаруживается, другой автор получает произ водные по схеме В, анализирует их на колонке У и указывает пик аргинина. Неизвестно, то ли первому исследователю не удалось получить желаемое производное аргинина, то ли он
88 |
ГЛАВА 2 |
получил другое соединение, которое разложилось на колонке или же необратимо адсорбировалось на носителе жидкой фазы. Для того чтобы не смущать читателя подробным разбором лите ратуры—статья за статьей или метод за методом,—мы рассмот рим сначала те методы, которые представляют исторический интерес, имеют ограниченное или специальное применение или же являются новыми и еще недостаточно исследованными. За тем в специальном разделе будут рассмотрены методы с исполь зованием ТМС-производных, которые, хотя и кажутся многообе щающими, еще не завоевали положения ацилэфиров. Ацилэфирные методы, как было показано, являются количественными, воспроизводимыми и применимы к широкому кругу аминокис лот. К разделу, в котором рассматриваются эти эфиры, следует обращаться для решения проблемы поиска практического ме тода— выбора эфира, ацильной группы, носителя или жидкой фазы. В рамках всех этих понятий мы обсудим как можно более подробно вопросы, касающиеся химии процесса и собственно хроматографии. Мы надеемся, что те, кому нужен метод, найдут его и смогут оценить его преимущества и недостатки. Для же лающих последовать методу определенного автора приводятся ссылки на оригинальные работы или на какой-либо из послед них обзоров [11, 36, 132].
2.2. МЕТОДЫ, ИМЕЮЩИЕ ИСТОРИЧЕСКИЙ ИЛИ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНТЕРЕС, А ТАКЖЕ МЕТОДЫ СПЕЦИАЛЬНОГО ПРИМЕНЕНИЯ
2.2.1. Окисление нингидрином
Самый ранний метод газохроматографического анализа ами нокислот (1956 г.) состоит в декарбоксилировании и дезамини ровании нингидрином [64]. В результате образуются альдегиды, имеющие на один углеродный атом меньше, которые затем раз деляют с помощью ГХ
О
*■
о
о
о
ГАЗОВАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ АМИНОКИСЛОТ |
89 |
Некоторые аминокислоты были определены по этой реакции в 1947 г., когда альдегиды фракционировали перегонкой с паром. Затем последовало ограниченное число разработок этого ме тода [4, 6, 7, 65], были также предприняты попытки сократить процедуру, проводя реакцию аминокислот с нингидрином в хро матографической колонке при повышенной температуре [148, 149]. В качестве декарбоксилирующих агентов использовали также дифенилметан и /г-диметиламинобензальдегид, однако удалось получить выходы лишь от 40 до 80% [7, 33].
Нингидриновый метод применим не ко всем аминокислотам и не используется больше, по-видимому, с 1960 года. В резуль тате этого метода глицин образует полимеризующийся формаль дегид, тогда, как гистидин, аргинин, триптофан, цистеин, аспа рагиновая и глутаминовая кислоты, очевидно, не пригодны для анализа этим методом [7]. В качестве жидкой фазы использо вали и силиконы [7, 164, 158], и полиэфиры [4, 149]. Предприни мались попытки [121] декарбоксилирования в присутствии N-бромсукцинимида (БСИ), однако образующиеся нитрилы и альдегиды, содержащие на один углеродный атом меньше, имели различные количественные соотношения в зависимости от характера аминокислоты.
RCH(NH2)COOH -^1>. RCH(NH2)Bt + С02
/ \
RCN RCHO
2.2.2.Метиловые эфиры а-хлораминокислот
а-Моноаминодикарбоновые кислоты переводили действием соляной и азотной кислот в а-хлоркислоты, которые затем этерифицировали диазометаном. Таким образом удалось количе ственно определить на силиконовых и полиэтиленгликолевых жидких фазах восемь аминокислот [88].
RCH(NH2)COOH + НС1 + HN03 — v RCH(Cl-)COOH + Н20 + N20
RCH(CI)COOH + CH2N2 — ►RCH(Cl)COOCH3 + N2
2.2.3.Метиловые эфиры 2,4-динитрофениламинокислот
ДНФ-аминокислоты разделяли на силиконовых жидких фа зах [67, 69, 79, 96], а также на полиэфирах [79, 80] после этери фикации диазометаном или трифторидом бора в метаноле [96].
0 2N— |
— F + H2NR |
0 2N— ^ — NHR + HF |
|
Vro2 |
\ no2 |
1 -фтор-2,4-динитробензол ДНФ-аминокислота
90 |
ГЛАВА 2 |
По нескольким причинам эти производные представляют особый интерес. Наличие ДНФ-группы придает специфичность,
атакже позволяет использовать электронозахватные детекторы
счувствительностью до 3- 10~10 моль/с [79]. Хотя ДНФ-производ- ные использовали для определения N-концевых аминокислот и последовательности пептидов, их рассмотрение будет ограничено установлением последовательности в тех пептидах, которые с трудом поддаются очистке или доступны в малых количествах. В общем же случае они оказываются непригодными, поскольку аминокислоты с дополнительными функциональными группами нельзя разделить без дальнейшей обработки. Оксигруппы трео нина, серина и оксипролина обрабатывали триметилсилилирующими реагентами [67], но триптофан и тирозин, по-видимому, не удалось удовлетворительно хроматографировать (см. разд. «Об суждение» в работе [96]).
2.2.4.Фенилтиогидантоины аминокислот
N =C =S + H2NCHCOOH
R
Фенилизотноцианат
(\ />— NH—CS—NH—СН—СООН
j H* |
I |
|
R |
N----- CS |
+ Н гО |
ОСх /N H |
|
СН |
|
R
ФТГ-аминокислоты
Эти производные тоже использовали для определения N-кон цевых аминокислот и последовательности пептидов [34]. Они хорошо-хроматографируются на силиконовых жидких фазах, од нако известную трудность представляют серин, треонин, аспара гин, глутамин и основные аминокислоты [96]. Вторую кар боксильную группу аспарагиновой и глутаминовой кислот предварительно этерифицировали трифторидом бора в метаноле. Можно думать, что ГХ этих производных, как и ДНФ-производ- ных, не найдет широкого применения.
2.2.5.Метиловые эфиры \^-диметиламинокислот
Восстановительная конденсация аминогрупп пептида с аль дегидами, приводящая к N, N-диалкилпептиду, исследована в 1950 г. [16]. При конденсации с водным формальдегидом после