Файл: Новые методы анализа аминокислот, пептидов и белков..pdf

термоионный детектор обладает тем преимуществом, что он на­ много более специфичен для фосфорсодержащих аминокислот. До настоящего времени получены аминокислоты, фосфорилированные только по а-аминогруппе [35].

2.2.8.Эфиры алкилиден- и алкиламинокислот

Хлоргидраты метиловых эфиров аминокислот реагировали с изомасляным альдегидом и сульфитом натрия в растворе кар­ боната натрия согласно следующему уравнению [31]:

Образующиеся эфиры алкилиденаминокислот хроматографиро­ вали как таковые или же восстанавливали цинковой пылью в метанольном НС1 до алкиловых эфиров

RCHCOOCH3

I

HNCH2R'

Эти производные разделяли на капиллярных колонках с карбоваксом 1540. Этот метод имеет, по-видимому, ограниченное применение, так как получены выходы лишь 50—70%, а произ­ водные аргинина и гистидина подвергались разложению.

2.2.9.Иодсодержащие аминокислоты *

Для иодсодержащих аминокислот, важных для медицинских целей, характерен низкий уровень их нормального содержания в крови, поэтому для их разделения решено было использовать присущую ГХ чувствительность. Клинический интерес представ­ ляют шесть аминокислот: моноиодтирозин, дииодтирозин, дииодтиронин, 3,3',5'- и 3,5,3'-трииодтиронин, а также 3,5,3',5'-тетра- иодтиронин. Для этих соединений приняты сокращения МИТ, ДИТ, Тг, Тз, «обратный» Тз и Т4. Аминокислота Т4— это тироидный гормон тироксин, тогда как Тз обладает аналогичной, но еще большей физиологической активностью, а обратный Т3 дей­ ствует как антагонист Т3 и Т4. Относительно концентраций этих веществ у больных и у здоровых людей имелись различные мнения [97, 133, 134], что стимулировало поиск новых методов анализа. Присутствие иода в аминокислотах позволяет приме­

* С м . т а к ж е р а зд . 2.7.7.

нять чувствительный электронозахватный детектор, но трудность состоит в том, чтобы придать летучесть таким большим поляр­ ным молекулам (молекулярный вес тироксина 777) и разделить их на колонках при умеренных температурах. Большая часть работ выполнена на искусственных смесях иодсодержащих ами­

нокислот.

Силильные производные приготовлены реакцией соответ­ ствующих аминокислот с БСА * [1, 3, 112]. Использовали и другие силилирующие реагенты, ТМХС и ГМДС [112], которые, как оказалось, не приводят к 100%-ному превращению в ТМСпроизводное. Во всех работах получено удовлетворительное раз­ деление на колонках с силиконовыми фазами, однако сведения об анализах природных смесей отсутствуют. Только в одной ра­ боте [3] упоминается о трудностях при экстракции природных смесей из крови. В той же работе [3] продемонстрировано опре­ деление МИТ в количестве до 6 *10-12 моля с помощью электро­ нозахватного детектора, а в работе [112] сообщается об опреде­ лении до 6 • 1011 моля МИТ с использованием пламенно-иони­ зационного детектора. Указанные чувствительности как раз имеют порядок величин, позволяющий анализировать один или несколько миллилитров цельной крови. Недостатком триметилсилилирования является его заметная неспецифичность, поэтому многие из сопутствующих соединений образуют производные, появляющиеся на хроматограммах при использовании пламенно­ ионизационного детектирования. Электронозахватный детектор должен устранить этот недостаток. Иодированную контрастную среду, которая может мешать количественному анализу иодиро­ ванных аминокислот, предварительно отделяют от их ТМС-про-

кзводных при использовании ГХ.

Метиловые эфиры иодированных аминокислот синтезировали при использовании НС1 в метаноле [70, 102] или тионилхлорида в метаноле [70, 122], а полученные эфиры ацилировали затем трифторуксусным [102] или пивалиновым ангидридом [70, 122]. Метиловые эфиры трифторацетильных производных хорошо разделялись на жидкой фазе SE-30 с пламенно-ионизационным

Для анализа крови использовались лишь Ы,0-дипивалоилмети- ловые эфиры; удовлетворительные результаты Получены с 5 мл сыворотки, жидкой фазой OV-17 и электронозахватным детек­ тором. Тз хроматографировали в количестве 10-12 моля — теоре­ тически такое малое количество можно получить приблизительно из 0,02 мл цельной крови. Ацетильная группа для ацилирования не применялась, однако нет видимых причин, по которым

С ок р ащ ен ия см . в р а зд . 2.6.

1М,0-ацетилметиловые эфиры должны труднее получаться ими, быть менее устойчивыми, они должны также легче подвергаться хроматографическому разделению. Уксусная кислота более ле­ туча, чем пивалиновая, поэтому можно ожидать, что ацетиль­ ные производные окажутся более летучими, чем пивалильные.

СНз

N, О-дипивалоилметиловый эфир Т4

Известно, что ДИТ встречается в некоторых кораллах, где ему иногда сопутствует дибромтирозин. С помощью ГХ эти сое­ динения можно легко идентифицировать и анализировать.

2.2.10.Сульфо- и селеноаминокислоты

2.2.10.1.Серусодержащие аминокислоты

Метионин и цистеин, а также некоторые продукты распада метионина хроматографировали рядом методов, однако воз­ никли сомнения относительно того, какие же продукты распада были подвергнуты хроматографическому анализу. Цистин и цистеиновая кислота, по-видимому, представляли трудности для большинства исследователей, в особенности это касается их N-ацилэфиров. Цистеиновая кислота, вероятно, слишком полярна вследствие наличия — SO3H группы, тогда как молекула цистеина очень большая (М 240) и с трудом этерифицируется [41]. Исследовали ТМС-производные цистеина, цистина, цистеиновой кислоты, ряда небелковых серусодержащих амино­ кислот и продуктов распада (S-метилцистеин, таурин, гомоцис­ тин, дьенколевая кислота и этионин [111], а также цистеинсульфиновая кислота [18]). С использованием БСА [118, 111] и БСТФА [111]* достигались различные степени превращения. БСТФА [111] наиболее пригоден для всех перечисленных выше аминокислот, за исключением S-метилцистеина, более высокую степень превращения которого обеспечивает БСА.

С ок р ащ ен и я см , в р а зд . 2.6.