Файл: Новые методы анализа аминокислот, пептидов и белков..pdf

24 ч. Позднее была опубликована ускоренная методика анализа белковых гидролизатов на смешанных смолах: за 6 ч 20 мин и 4 ч при скорости течения буфера соответственно 40 и 60 мл/ч. Эти смолы размалывались и фракционировались по методу, сходному с методом Гамильтона [128]*. Анализ физиологиче­ ских жидкостей по двуколоночному методу, предложенному Спэкманом [129], при скорости течения буфера 50 мл/ч занимает 16 ч. Применение порошкообразных смол для хроматографии аминокислот имеет тот недостаток, что по мере их использова­ ния образуются мельчайшие частицы. В процессе размалывания смолы может иметь место ее растрескивание вдоль участков с более низкой сшитостыо в негомогенной матрице [103]. При ис­ пользовании смолы частицы, в которых образовались трещины, могут разрушаться при трении, что приводит к повышению рабо­ чего давления. Из-за отсутствия воспроизводимости смолы от партии к партии приходилось смешивать различные фракции для получения оптимальных результатов; специфические же смеси определенного фракционного состава в настоящее время недо­ ступны.

1.3.2.2.Сферические смолы

Для устранения указанных выше недостатков оказалось вы­ годным производить смолы с определенными характеристиками. Так, сферическая смола типа АА-15** позволяет анализировать все кислые и нейтральные аминокислоты белковых гидролиза­ тов за 4 ч при высоте столбика смолы 56 см; основные амино­ кислоты анализируются на колонке высотой 5 см, заполненной смолой типа РА-35 [130]. Позднее была получена смола типа РА-28, применяемая для анализа аминокислот, обычно обнару­ живаемых в таких пробах, как плазма крови или моча. Кислые и нейтральные аминокислоты определяются по методу анализа физиологических жидкостей на этой смоле за 5 с лишним часов; основные аминокислоты анализируются в этом случае почти за 6 ч на упомянутой выше смоле типа РА-35 [88]. Названные смолы дают очень сильное увеличение высоты пиков, свидетель­ ствующее о том, что аминокислоты элюируются из сферической смолы в виде более узких зон, улучшая разделение пиков. Не­ сколько позднее появилась смола типа UR-30, с помощью кото­ рой можно анализировать кислые и нейтральные аминокислоты как белковых гидролизатов, так и физиологических жидкостей. Преимуществом этой смолы является также и то, что на ней

*Поставщиком таких молотых смол является фирма «Beckman-Spinco» (Пало-Альто, Калифорния).

**Смолы, указанные в этом разделе, производит фирма «Beckman-Spinco»

(Пало-Альто, Калифорния).

2’

36 ГЛАВА Т

развивается меньшее рабочее давление и она обеспечивает луч­ шее разделение по сравнению с ранее известными смолами. Для оптимального разделения кислых и нейтральных аминокислот высота столбика смолы UR-30 в колонке должна составлять 56 см, а диаметр — 0,9 см.

Сокращение времени анализа стало возможным главным об­ разом благодаря улучшению конструкции и надежности анали­ заторов аминокислот. Этому способствовало также совершенст­ вование и создание сферических ионообменных смол, которые используются в специальных хроматографических системах. Улучшенные смолы дают возможность использовать более ко­ роткие колонки при сохранении достаточного числа теоретиче­ ских тарелок, которое позволяет разделять большое количество различных аминокислот, хроматографируемых обычно по более сложной методике анализа физиологических жидкостей. Так, ре­ альностью стал анализ кислых и нейтральных аминокислот бо­ лее сложных физиологических жидкостей, приблизившийся по времени к анализу простых белковых гидролизатов.

Сравнительно недавно синтезирована смола типа UR-40, ко­ торая позволяет определять кислые и нейтральные аминокис­ лоты по методике анализа физиологических жидкостей за 170 мин на колонке высотой 26 см. Основные аминокислоты физио­ логических жидкостей также могут быть определены на этой же колонке за 210 мин. Одноколоночный метод анализа белковых гидролизатов на этой смоле описан в разд. 1.6. Использование более коротких колонок и улучшение разделения пиков амино­ кислот стало возможным благодаря устранению специфических перемешивающих узлов (таких, как реактор, подводящие труб­ ки, краны и кюветы), имеющихся в большинстве приборов.

1.3.2.3.Пелликулярные смолы

Поскольку смола является сердцевиной любой жидкостной хроматографической системы, следует ожидать дальнейших усо­ вершенствований в этой области. Сравнительно недавно было опубликовано сообщение [131] о получении особых смол. «Пел­ ликулярные» (pellicular) смолы, о которых мы говорим, имеют контролируемые активные матрицы, которые стабилизируются на инертных сферических поверхностях. Таким образом можно получить смолу с высокой кинетической скоростью ионного об­ мена без пропорциональной потери объемной емкости. В резуль­ тате для смол с такими характеристиками требуется меньшее количество пробы и сокращается время анализа.

В дальнейшем усовершенствование матрицы смолы будет идти по пути создания активных участков. Эти участки должны быть высокоселективиыми по их ионообменной направленности.

38 ГЛАВА I

смоле ионами металла. При использовании буферного элюента, изменяющего заряд на смоле, мы имеем

7 п++

RS03Zn[AA] — :—-------RS03Zn+ + [АА]+. Н+, pH 3,2

При изменении заряда в результате увеличения концентрации водорода (Н+) устанавливается новое равновесие.

По существу лигандная система превращает катионообмен-

ник (RS03Na+) в анионообменник, что приводит к лучшему хро­ матографическому разделению аминокислот в карбоксильной форме, так как в этой форме (рКа) они имеют больший коэф­ фициент распределения, чем в форме свободного основания

(р/Сь) -

Кроме того, лигандный комплекс металла со смолой стаби­ лизирует ее гидратированное состояние. В обычных условиях степень гидратации смолы определяется ее катионной формой (Na+, К+, Li+ и т. д., которые обмениваются с другими катиона­ ми). Однако в рассмотренной лигандной системе Zn++ не обме­ нивается и изменения степени гидратации смолы не происходит. Помимо этого, уменьшается и гидратация аминокислот. Коли­ чество воды, обмениваемой аминокислотами в анионной форме, становится минимальным.

Хотя лигандная хроматография является более эффективным методом благодаря более широкому спектру рКа, что позволяет лучше разделять аминокислоты, следует учитывать ряд обстоя­ тельств. Большое значение имеет химическая и физическая ста­ бильность смолы. Значительное внимание должно быть уделено также чистоте буферной системы. Поддержание равновесия ионов металла между смолой и элюирующими буферами суще­ ственно для получения воспроизвсдимой картины деления ами­ нокислот (идентификация пиков). Кроме того, очень важны тре­ бования к скорости течения буфера и рабочим температурам. Изготовление смол с более высокой стабильностью и контроль за концентрацией иона металла в системе устранят многие трудности и позволят использовать в полной мере все возмож­ ности этого метода.

1.3.5.Гидролиз пептидов в потоке жидкости

Обычно пептиды при реакции с нингидриновым реагентом дают слабое окрашивание, так как они реагируют только сво­ бодной аминогруппой. Если же пептид подвергнуть щелочному гидролизу, то все освобождающиеся аминокислоты будут реаги­ ровать с нингидрином, давая интенсивное окрашивание. Метод

дает с приблизительной точностью число присутствующих в пептиде аминокислот, указывая на его величину.

1.4.ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА КАЧЕСТВО АНАЛИЗА

1.4.1.Приготовление пробы

Приготовление пробы для количественного хроматографиче­ ского анализа требует строгого соблюдения всех условий, обес­ печивающих полноту определения аминокислот.

Для анализа всех аминокислот в биологическом материале образец должен быть вначале подвергнут гидролизу. При этом разрываются все пептидные связи, освобождая аминокислоты. Часть раствора гидролизата может быть затем проанализиро­ вана на той или иной колонке в зависимости от того, какие аминокислоты нужно определить.

Если требуется определить только свободные аминокислоты и родственные им соединения, то необходимо, чтобы проба не содержала белка. Очень малые количества белков плазмы, как правило, не оказывают влияния на анализ, но они могут гидро­ лизоваться на колонке и влиять на последующий анализ. Боль­ ших количеств белка в пробе следует избегать, так как белок прилипает к ионообменной смоле и блокирует поток буфера.

Для удаления белка из биологических образцов были ис­ пользованы четыре метода, основанные на применении сульфосалициловой кислоты, пикриновой кислоты, ультрафильтрации и центрифугирования [6, 76, 137—140]. По методу удаления белка с помощью сульфосалициловой кислоты супернатант можно наносить на колонку. При использовании пикриновой кислоты ее избыток можно удалить экстракцией- с помощью анионообменной смолы или путем добавления небольших пор­ ций этой смолы к супернатанту и последующего фильтрования

или декантации с осадка смолы.

Метод ультрафильтрации в диализных трубках «вискинг» под избыточным давлением азота при 40 °С в течение ночи ока­ зался менее удовлетворительным, чем метод Де-Вольфе [138] с использованием сульфосалициловой кислоты. Гамильтон [85] по­ казал, что 3%-ная (вес./об.) сульфосалициловая кислота при добавлении к плазме может быть впоследствии отделена цент­ рифугированием (13 500 об/мин). Чистый супернатант, содер­ жащий аминокислоты, можно затем нанести прямо на колонку.

Геритсен с сотр. [139] предложил метод определения сво­ бодных аминокислот в сыворотке и тканевых экстрактах, по