Файл: Методики постановки опытов и исследований по молочному хозяйству [сборник]..pdf

VI. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФОСФОЛИПИДОВ

С. А. ЛУЧКИНА

■При исследовании фосфолипидов применяют метод тонко­ слойной хроматографии, позволяющий быстро разделить смесь фосфолипидов на индивидуальные компоненты. 'На ка­ федре частично модифицирован ряд методик, объединенных в единый процесс, позволяющий установить содержание фос­ фолипидов в молоке и молочных продуктах.

Главные операции следующие:

1 . Экстрагирование фосфолипидов и очистка их (в основе метод J. Folch et al., 1957).

'2 . Разделение смеси фосфолипидов на тонком слое сили­ кагеля и идентификация их (в основе метод Э. В. Дятловской

идр., 1959).

3.Количественное определение фосфолипидов по фосфору (в основе метод De Bohner L. S. et al.,.1965).

Экстрагирование. Применяют смесь хлороформ—метанол

(2 : 1), разрушающую липопротеиновые комплексы и экстра­ гирующую одновременно с фосфолипидами нейтральный жир и свободные жирные кислоты.

Натуральное или сгущенное молоко предварительно обез­ воживается ацетоном (сухое цельное молоко используется не­ посредственно), так как вода затрудняет извлечение липидов. С этой целью продукт (20 г) измельчают в 5-кратном объеме ацетона в течение 5 мин. при 4000 об/мин. на микроразмельчителе тканей. .Гомогенат фильтруют через стеклянный фильтр № 4 в перегонную колбочку. Сухой остаток с фильтра-

куда предварительно удаляют смесь ацетон —вода в вакуум-

67

ном испарителе при температуре 30°, поскольку ацетон ча­

стично экстрагирует липиды.

Очистка. Липидные экстракты, выделенные смесыо хлоро­ форм-метанол, содержат нелипидные примеси — мочевину, лактозу, аминокислоты, мешающие дальнейшему анализу. Для удаления их экстракт переносят в делительную воронку и взбалтывают с 20 мл 0,37%-ного КС1, после чего оставляют на 2,5 часа. Верхний спирто-водо-солевой слой, не содержащий липиды, удаляют. Нижний хлороформенный слой, содержащий чистые липиды, сливают в перегонную колбочку. Раствори­ тель отгоняют под вакуумом при 40° до постоянного веса. Очи­ щенный экстракт представляет собой смесь фосфолипидов, ней­ трального жира, свободных жирных кислот, жирорастворимых витаминов и используется для определения общего содержа­ ния фосфолипидов и фракционирования смеси. Используемый метод позволяет извлечь до 98% общих липидов молока.

Разделение. Для отделения от других фракций и разделе­ ния фосфолипидов применяют двухмерную тонкослойную хро­ матографию. Метод основан на том, что отдельные фосфоли­ пиды, в соответствии с полярными свойствами их молекул, постепенно поглощаются адсорбентом из движущегося раство­ рителя. Нейтральный жир и свободные жирные кислоты вы­ носятся с фронтом растворителя, а жирорастворимые витами­ ны остаются на старте.

В качестве адсорбента используют силикагель, размер ча­ стиц 70—100 мк. Для получения зерен такой величины сили­ кагель марки КСК, предварительно размолотый на шаровой мельнице, просеивают через сито с отверстиями около 10 0 мк. Для удаления самых мелких частиц порошка производится отмучивание его в 1 0 -кратном объеме дистиллированной воды

втечение 3,5 час. Затем воду удаляют, а осадок высушивают при 105° в течение суток, вновь просеивают и смешивают с 5% гипса.

Готовый порошок в количестве 12 г интенсивно взбалты­ вают с 32 мл воды в закрытой колбочке. Полученную массу равномерно наносят на обезжиренную стеклянную пластинку (18x20 см). Для выпаривания воды ее помещают строго гори­ зонтально. Толщина адсорбционного слоя 400—500 мк. Перед нанесением экстракта хроматографические пластинки выдер­ живают в сушильном шкафу в течение 1 час. при 105°, затем охлаждают на воздухе.

Хлороформенный раствор липидов наносят'микропипеткой

водну точку на пластинке (рис. 7, пятно 7) в количестве, со-

68

ответствующем содержанию 8 — 10 мкг липондного фосфора. Затем пластинки помещают вертикально в круглую хромато­ графическую камеру (высота 25 см, диаметр 25 см) с крыш­ кой, куда предварительно налито 350 мл I системы раствори-; телей, состоящей из хлороформа, метанола и воды в соотно­ шении 65:25: 4. Глубина погружения пластинки не более 1 см, время разделения в направлении I около 90—100 мин. Затем пластинки просушивают на воздухе в течение 30 мин. и поме­ щают в такую же хроматографическую камеру, куда предва­ рительно налито 350 мл II системы растворителей, состоящей из хлороформа, метанола и аммиака в соотношении 14:6:1. Процесс разделения в направлении II занимает 30—40 мин.

Растворители перед непосредственным употреблением обез­ воживают и очищают по методикам, описанным в книге Ю. К.

Юрьева (1964).

Идентификация фосфолипидов. Расположение пятен инди­ видуальных фосфолипидов на хроматографической пластике устанавливается с помощью цветных реакций на характерные! функциональные группы молекул.

Фосфолипиды, содержащие свободные аминогруппы (фосфатидилэтаноламин, лизофосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин), окрашиваются в красный цвет при опрыскивании пла­ стинок 0 ,2 %-ным нингидрином в смеси n-бутана и уксусной кислоты (95:5) и нагревании при 120° в течение 10 мин. Хо­ линсодержащие фосфолипиды (фосфатидилхолин, лизофосфатидилхолин, сфингофосфатид) окрашиваются в желто-оранже­ вый цвет при опрыскивании реактивом Драгендорфа (смеши­ ваются раствор 850 мг основного азотнокислого висмута в 40 мл воды и 70 мл уксусной кислоты и 8 г йодистого калия в 2 0 мл воды; перед употреблением 1 мл исходного раствора разбавляют 2 0 мл уксусной кислоты и 10 мл воды).

Фосфатидилинозит дает бурое окрашивание при опрыски­ вании раствором азотнокислого серебра в уксусной кислоте.

На рис. 7 показаны хроматограммы фосфолипидов, экстра­ гированных из молока. Разделение в направлении I (рис. 7 а) в системе хлороформ— метанол—вода позволяет отделить ней­

4)лизофосфатидилхолин-f лизофосфатидилэтаноламин. Разделение в направлении II (рис. 7 б) в системе хлоро-

69

рожно переливают в термостойкие пробирки с делением 5 мл. Процесс повторяют дважды.

Для определения общего содержания фосфолипидов в тер­ мостойкие пробирки помещают хлороформенный раствор ли­ пидного экстракта, соответствующий 2 —3 мкг липоидного фос­ фора. Далее растворитель упаривают досуха на водяной бане при 86—90°. К сухому остатку приливают по 0,5 мл смеси, со­ стоящей из равных объемных частей концентрированных хлор­ ной и серной кислот.

Пробирки нагревают при 180—120° до полной минерализа­ ции содержимого. После охлаждения приливают 4 мл 1%-ного молибдата аммония и 0,2 мл реактива Фиске-Суббароу.

После тщательного встряхивания пробирки помещают в ки­ пящую водяную баню на 10 мин., затем охлаждают в течение 20 мин. при комнатной температуре и содержимое их доводят дистиллированной водой до 5 мл. Окрашенные растворы фотометрируют на спектрофотометре при длине волны 836 ммк в прямоугольных кюветах, сравнивая с контролем.

Исходный раствор для построения калибровочной кривой содержит 1000 мкг Р в 1 л (4,3868 г КН2Р 0 4 растворяют в 1 л дистиллированной воды). Из него готовят серию рабочих рас­ творов в мерных колбах на 1 л (табл. 13).

Для сжигания берут растворы, объемы которых не превы­ шают 0,2 мл. Далее все операции выполняют, как при опреде­ лении липидного Р. На основе калибровочной кривой (рис. 8 ) составляют табл. 14, по которой находят количество Р, соответ­ ствующее экстинкции. Содержание фосфолипидов находят пу­

71