Файл: Методики постановки опытов и исследований по молочному хозяйству [сборник]..pdf

Вмерную колбу на 100 мл Пипеткой отмеривают 10 мл мо­ лока (10,3 г), разбавляют его 50 мл дистиллированной воды (t° 40—42°) и приливают 1,5 мл 10%-ного раствора уксусной кислоты. Содержимое перемешивают и оставляют на 20 мин. Затем в колбу прибавляют 4,5 мл 0,25 н. раствора уксуснокис­ лого натрия и до метки доводят водой. Содержимое колбы еще раз перемешивают и спустя час фильтруют (фильтрат дол­ жен быть прозрачным).

Вколбу Кьельдаля отмеривают пипеткой 25 мл фильтрата

иприбавляют 0,5 мл концентрированной серной кислоты. Со­ держимое колбы выпаривают через асбестовую сетку до не­ большого объема. После охлаждения в колбу вносят 10 мл концентрированной H2S 04. В последующем сжигание и разбайление ведут так же, как и для небелкового азота, а отгон­ ку — как для общего азота.

правкой к титру 1,011. На титрование содержимого колбы из­

Азот казеина. Количество азота казеина N k определяют по разности между общим количеством азота в молоке N и коли­ чеством неказеинового азота N1.

Д1„ ='N—N1.

Пр име р . Если общего азота в молоке содержится 0,524%,

а неказеинового — 0,124, то Мк =0,524—0,124 = 0,400%.

79

Среднее содержание в молоке азота казеина равно 0,417% с колебаниями от 0,362 до 0,518%.

Азот растворимых белков. Содержание азота альбумина и глобулина молока N2 определяют по разности между количе­ ством неказеинового азота Nj и небелкового азота NH.

n 2 = n , - n h .

Пр и ме р . Если неказеинового азота в молоке содержится

0,124%, а небелкового — 0,0251, то N2 будет 0,124—0,0251 = = 0,099%.

Среднее содержание азота растворимых белков равно

0,091% с колебаниями от 0,068 до 0,117%.

П р и б о р ы и р е а к т и в ы : аппарат для отгонки аммиа­ ка, колбы Кьельдаля на 50, 100, 250 мл, селен металлический, серная кислота (удельный вес 1,84), индикатор Ташира, 40%-ный раствор едкого натрия, 0,01 н. раствор едкого натрия, 0 ,0 1 н. раствор серной кислоты, 18%-ный раствор трихлоруксусной кислоты, 10%-ный раствор уксусной кислоты, 0,25 н. раствор уксуснокислого натрия.

Приготовление индикатора Ташира. Приготавливают два раствора: 1) 0 , 1 % - н ы й спиртовой раствор метилрота красного. Для этого в мерной колбе на 100 мл в этиловом спирте рас- TBqpniOT 1 0 0 мг метилрота, 2 ) 0 , 1 % - н ы й спиртовой раствор метиленовой сини ( 1 0 0 мг сини растворяют в этиловом спирте).

80

Далее 40 мл 0,1%-ного раствора метил;рота смешивают с 10 мл 0 ,1 %-ного раствора метиленовой сини. Из полученной смеси приготавливают рабочий раствор путем добавления к 25 мл смеси 50 мл дистиллированной воды и 25 мл этилового спирта.

Определение количества белков (общий белок, казеин и альбумин + глобулин)

Общее количество белков определяют путем умножения ко­ личества белковых веществ Ng на коэффициент 6,38, который

ножения количества азота, содержащегося в этих белках, на

а растворимых 0,63%, то количество казеина Б 1С= 3,18—0,63 = = 2,55%.

Количество казеина можно определить умножением азота казеина на 6,38.

Пр и ме р . Если азот казеина в молоке составляет 0,400%, то содержание белка казеина — 0,400-6,38 = 2,55%.

Содержание отдельных фракций белков в молоке равно

(в %):_________________________________________________

Разделение белков молока на фракции методом электрофореза

Под действием электрического тока белки разделяются на отдельные фракции благодаря их неодинаковой скорости дви­ жения на хроматографической бумаге. Фракции в виде пятен окрашиваются и колориметрируются.

Водорастворимые белки. В химический стакан емкостью 1 л отмеривают 0,5 л обезжиренного молока (обрата), нагрето­ го до 30°. Казеин осаждают 1 и. раствором уксусной кислоты, которую добавляют постепенно до полного осаждения белков, образования четких хлопьев. Сыворотку отделяют фильтра­ цией через складчатый фильтр. С помощью 1 н. раствора NH4OH pH доводят до 6,5. Этот процесс проводят в отдельной пробе при универсальном индикаторе. При окончании нейтра­ лизации появляется лимонно-желтая окраска со слабо-зелено­ ватым оттенком.

В последующем для осаждения (высаливания) сывороточ­ ных белков в сыворотку вносят кристаллический сульфат ам­ мония из расчета 70 г на 100 мл.

Рис. 10. Горизонтальная камера для электрофореза белков молока на бумаге:

1 — стеклянные плечики для подвешивания бумаги; 2 — кюветы для вероналового буфера; 3 — кюветы для электродов; 4 — электроды

82

веты с электродами соединяют перемычкой из фильтроваль­ ной бумаги с кюветами, где помещены полоски бумаги. На дно камеры между кюветами наливают дистиллированную воду (для насыщения камеры парами). На стартовую линию по­ лоски бумаги, помещенной в камеру, в одну точку наносят фильтрат в количестве 3—4 капель при Помощи пипетки. Ка­ меру закрывают крышкой и включают ток.

В горизонтальной камере электрофорез проводят при на­ пряжении 180—190 в переменного тока в течение 18 час. Сила тока не должна превышать 0,5—0,7 миллиампер на каждую полоску бумаги.

По истечении времени ток выключают, а полоски бумаги на плечиках переносят в сушильный шкаф при 105° на 15—20 мин.

Сухие фореграммы помещают в эмалированную ванночку с раствором бромфенолблау на 10—20 мин. Затем их промы­ вают 5— 6 раз 2%-ным раствором уксусной кислоты, пока жидкость и свободные от белков участки бумаги не станут бесцветными. Фореграммы высушивают при 105°. Чтобы участ­ ки белковых фракций, окрашенные бромфенолблау, были четкими, фореграмму держат несколько секунд над аммиаком.

Для определения фракций сывороточных белков участки фореграммы, занятые отдельными фракциями, вырезают. Кроме того, вырезают такой же площади и свободный участок фореграммы для холостой пробы.

Каждый вырезанный участок измельчают, помещают в про­ бирку, заливают 15 мл 0,01 и. NaOH и через каждый 15 мин. жидкость в пробирках осторожно перемешивают. Элюация продолжается в течение часа, раствор приобретает синий цвет. Затем приступают к колориметрированию (определению экстинкции) на приборе ФЭК-М при нейтральном светофильтре. При этом обычно используют 30 мм кюветы.

В сывороточных белках в порядке возрастания от старто­ вой черты будут следующие фракции: иммунные глобулины, а-лактоальбумин, р-лактоглобулин и сывороточный альбумин. Расположение фракций представлено на рис. 11.

Пр и м е р .

Сывороточные белки молока коров

а-лактоальбумин............................ 0,676 Р-лактоглобулин............................. 1.150

84