Файл: Методики постановки опытов и исследований по молочному хозяйству [сборник]..pdf

ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ КАЗЕИНА

А, П, ЯРОШКЕВИЧ

Молоко фильтруют и охлаждают до температуры 3—4° С, после чего обезжиривают на лабораторной центрифуге при ско­ рости 3000 об/мин. Верхний, плотный слой сливок удаляют шпателем, нижний, жидкий — доснимают ватным тампоном. Обезжиренное молоко сильно разбавляют водой. Чтобы избе­ жать диспергирования частиц казеина, в молоко добавляют 0,08% формальдегида. Подготовленные образцы молока в те­ чение 24 час. выдерживают в холодильнике при температуре 3—4°, затем разбавляют в 300 раз охлажденной дистиллиро­ ванной водой и наносят на сетки, покрытые пленкой-под­ ложкой. ) -i

Коллодиевые или углеродные пленки-подложки изготавли-

О

вают толщиной не более 200 А. Такие тонкие пленки не раз­ рываются лишь на очень маленьких площадях (около 0,01 мм2), поэтому их помещают на опору — специальные медные сетки.

Электроны, которые формируют изображение белковых ча­ стиц, взаимодействуют и с пленкой. Поэтому, если толщина

пленки относительно велика (более 200 А) или материал, из которого она изготовлена, сильно рассеивает электроны, кон­ трастность изображения нанесенного на нее объекта резко ухудшается.

Коллодиевые пленки-подложки готовятся следующим об­ разом. Чашку диаметром 20 см наполняют дистиллированной водой. Пипеткой на середину водной поверхности наносят 2 капли 2%-ного раствора коллодия в амилацетате. Для очист­ ки поверхности воды от пылинок и пузырьков образующуюся после испарения растворителя (амилацетата) пленку удаляют иглой. Эту операцию повторяют дважды. Затем на середину поверхности вновь наносят каплю раствора. Она быстро рас­ текается, и после испарения амилацетата на воде остается тон-

92

кая пленка. Промытые в спирте сухие сетки пинцетом поме­ щают на середину пленки.

Обычно применяют электролитические сетки, состоящие из квадратиков со стороной 80 мкм (80 отверстий на 1 см2). У та­ ких сеток одна сторона блестящая, другая — матовая. Для лучшего прилипания подложку наносят на матовую поверх­ ность и сетку слегка прижимают к пленке иглой или пинцетом. Круглые сеточки располагаются на пленке рядами. Извлече­ ние из воды сеток с пленками производится промытыми спир­ том сухими предметными стеклами. Для этого зажатое паль­ цами стекло ставят под острым углом к поверхности пленки в направлении продольного расположения сеток. Быстрым движением к себе сетки поддевают и извлекают из воды. По­ кровное стекло с сетками и лежащей поверх них пленкой по­ мещают на фильтровальную бумагу под колпак для высыха­ ния, после чего сеточки легко снимаются со стекла. При ука­ занном способе вылавливания пленка ровно и плотно приле­ гает к матовой поверхности сетки и прочно на ней удержи­ вается. Плавающие в чашке обрывки пленки вылавливают чи­ стым предметным стеклом; после этого на водную поверх­ ность можно вновь наносить пленку.

Сеточки с высушенной пленкой помещают на металличе­ ские столбики специальных столиков и, прижав их к столбику иглой, в середину каждой тонкой пипеткой наносят каплю ис­ следуемого молока так, чтобы она не растекалась, а имела вид бусинки. Затем каждый столик накрывают колпаком во избежание попадания на образцы пыли.

Высушенные под колпаком препараты молока готовы для оттенения. В связи с тем, что в электронном микроскопе об­ разцы исследуют в высоком вакууме, они должны быть абсо­ лютно сухими.

Углеродные пленки-подложки получают методом вакуум­ ного распыления углерода в распылительной установке. Не­ смотря на некоторую сложность получения, углеродные пленки имеют ряд преимуществ перед коллодиевыми. Они химически абсолютно инертны, обладают большей прочностью, устойчи­ востью к электронной бомбардировке, могут иметь толщину

О

всего от 20 до 100 А. Очень тонкая структура фона углеродной пленки обладает низким контрастом и поэтому накладывает­ ся на структуру образца лишь в незначительной степени.

Для получения углеродной пленки-подложки тонкую пла­ стинку поваренной соли (площадь поверхности примерно 4—

93

5 см2, толщина 2—3 мм) полируют и помещают в напылитель­ ную установку. Здесь ее крепят зажимами на специальном столике на расстоянии 15 см от места соприкосновения элек­ тродов и под углом 90° к источнику распыления. В качестве источника распыления используются два заостренных графи­ товых стержня, помещенных в специальные изолированные держатели вакуумной установки. Один стержень закрепляют неподвижно, другой может перемещаться благодаря пружине, которая создает между заостренными концами незначитель­ ное давление. Устройство закрывают колоколом и из-под него откачивают воздух до получения высокого вакуума (10-4 мм рт. ст.). Через стержни пропускают ток силой около 50 ампер. Время распыления — примерно 0,5 сек. Пленка к концу напы­ ления приобретает коричневый цвет.

О толщине пленок судят по интенсивности окраски. Наи­

лучшими считаются пленки светло-шоколадного цвета, толщи-

о

на которых составляет около 100 А.

Для снятия углеродной пленки напыленную пластинку по­ варенной соли с помощью пинцета под острым углом посте­ пенно погружают в чашку с дистиллированной водой. Пленка отслаивается и всплывает на поверхность. В зависимости от площади полученной пленки используют сетку соответствую­ щего размера, разрезанную на прямоугольники. Сетку зажи­ мают пинцетом с острыми концами и погружают в чашку с во­ дой. Затем ее медленно подводят матовой поверхностью к пла­ вающей пленке и, подхватив последнюю на сетку, быстро пе­ реносят на фильтровальную бумагу для просушки. После вы­ сыхания пленки пробойником готовят круглые сеточки для на­ несения исследуемого образца.

Во избежание отрыва пленки от сетки каплю молока на­ носят на чистое предметное стекло, опускают на нее сетку пленкой кверху и оставляют до высыхания.

Белки молока слабо рассеивают электроны. Вследствие это­ го контрастность их изображения настолько мала, что даже при достаточной разрешающей способности микроскопа они слабо различимы. Для увеличения контрастности препаратов их оттеняют металлом, обладающим большой рассеивающей способностью электронов.

Оттенение препаратов осуществляют в специальной ваку­ умной установке. Сеточки с нанесенными на них и высушен­ ными препаратами молока укрепляют на специальном столике, установленном под углом 14—15° к источнику распыления.

94

ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ АМИНОКИСЛОТ МЕТОДОМ РАСПРЕДЕЛИТЕЛЬНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ НА БУМАГЕ

П. В. КУГЕНЕВ, Ю. Е. РАЗМАХНИН

При использовании этого метода распределение веществ обусловливается различными коэффициентами распределения компонентов смеси между двумя несмешивающимися жидко­ стями— подвижными и неподвижными растворителями. Не­ подвижным растворителем является вода, подвижным — водо­ насыщенный органический растворитель. Водная фаза непод­ вижна, потому что вода прочно удерживается фильтроваль­ ной бумагой. При движении подвижного растворителя через участок бумаги, на который нанесена смесь аминокислот, про­ исходит их рассредоточение. Скорость движения отдельных аминокислот неодинакова, что и приводит их к разделению. Наибольшей скоростью обладают аминокислоты, имеющие наименьший коэффициент распределения. Коэффициент зави­ сит от природы вещества, растворителя и температуры. По­ этому при одинаковых условиях движение и положение каж­ дой аминокислоты на хромотографической бумаге строго за­ кономерно.

Выявление аминокислот на хроматограмме основано на их реакции с нингидрином в слабокислой среде. В результате реакции образуется комплексное соединение — ДИДА, имею­ щее синевато-фиолетовое окрашивание, которое в дальней­ шем при реакции с азотнокислой медью переходит в стабиль­ ное медное производное оранжево-красного цвета.

При определении количества аминокислот измеряют опти­ ческую плотность медного производного ДИДА после элюи­ рования его из бумаги.

Метод применим для количественного определения всех аминокислот, кроме пролина и оксипролина. Эти две амино-

96

кислоты иначе реагируют с нингидрином и образуют медное производное другого строения.

Подготовка образцов к анализу. Среднесуточные пробы молока обезжиривают путем 2—3-кратного сепарирования. Из обрата осаждают суммарные белки молока (казеин, альбу­ мин, глобулин), добавляя 18%-ную трихлорукеусную кислоту (1 объем обрата + 4 -объема трихлоруксусной кислоты). Через час выпавший осадок отфильтровывают и промывают водой, пока pH промывной воды не будет ниже 4,5—5,0. В после­ дующем общие белки обрабатывают ацетоном (в отношении 1: 6), растирая в ступке. Осадок отфильтровывают или центри­ фугируют. Таким образом, белки обрабатывают не менее 3 раз. Затем белки растирают с эфиром, чтобы извлечь жир. После фильтрования осадок раскладывают тонким слоем на бумаге для просушивания при комнатной температуре. Белки, полу­ ченные в результате такой обработки, представляют собой тонко измельченный порошок.

Для выделения казенна из обрата, предварительно разбав­ ленного тройным объемом дистиллированной воды, используют 5%-ную уксусную кислоту. Основную массу прозрачной сы­ воротки удаляют декантацией, а остаток фильтруют. Осадок казеина растирают в ступке с водой, которую сливают на фильтр. Растирание повторяют 3—4 раза. Для дальнейшей очистки белок переосаждают. Для этого его растворяют в воз­ можно меньшем объеме 0,1 N щелочи (NaOH) и отфильтровы­ вают. Из прозрачного, слегка опалесцирующего раствора ка­ зеин вновь осаждают 5%-ной уксусной кислотой. Осадок про­ мывают водой для удаления уксусной кислоты. Затем казеин обрабатывают ацетоном и эфиром, как и суммарные белки.

Для выделения воднорастворимых белков фильтрат после первого осаждения казеина нагревают до 90° и выдерживают при этой температуре в течение 30 мин. Выпавший хлопьевид­ ный осадок представляет собой смесь альбумина и глобулина. Осадок обрабатывают так же, как и казеин, т. е. отфильтро­ вывают, промывают водой, переосаждают, обрабатывают аце­ тоном и эфиром.

Определение аминокислот производят в воздушно-сухих препаратах, которые сохраняются, что важно при массовых анализах.

Чтобы определить содержание аминокислот, белковые пре­ параты подвергают гидролизу. Для этого на аналитических весах отвешивают навеску около 1 г белка. Белок переносят в ампулу на 25—30 мл и заливают 20 мл 6 N (20%) соляной

кислотой. Ампулы запаивают и производят гидролиз белка при температуре 120° в течение 20 чае. при периодическом пе­ ремешивании.

Гидролиз белка можно также проводить в автоклаве при 3—3,5 атм. в течение 4 час., при этом ампулы не запаивают. В последующем охлажденный гидролизат разбавляют двой­ ным объемом дистиллированной воды и фильтруют для осво­ бождения от гуминовых веществ. Осадок на фильтре промы­ вают до тех пор, пока фильтрат станет бесцветным. Соляную кислоту удаляют многократной отгонкой под вакуумом, созда­ ваемым водоструйным насосом на водяной бане при темпера­ туре 60—70° (рис. 15). В отгонную колбу гидролизат вносят небольшими порциями. После того как в отгонной колбе гид-

Рис. 15. Аппарат для отгонки соляной кислоты из гидро­ лизата:

1 — отгонная колба для гидролизата с капилляром; 2 —

приемная колба с отгоняемой соляной кислотой, охлаж­ даемая водой; 3 — водоструйный насос, создающий раз­ ряжение в отгонной колбе; 4 — колба с серной кислотой

для очистки воздуха, поступающего в отгонную колбу; 5 — горелка; 6 — термометр

98

ролизат упарится до густой консистенции, к нему приливают по 3 мл воды и отгоняют ее не менее 5 раз для полного осво­ бождения от соляной кислоты. Затем осадок небольшими пор­ циями воды (до 3 мл) переносят в мерную колбу. Конечный объем для навески белка в 1 г в пределах 25 мл. Гидролизаты хранят в холодильнике.

Техника получения хроматограммы. С помощью трафарета на листе бумаги намечают точки нанесения исследуемых рас­ творов. Стартовая линия располагается на расстоянии 7—8 см от края листа. Расстояние между точками нанесения образцов не менее 3 см. Для каждого образца делают до 5 пятен с целью применения биометрической обработки полученных цифровых величин.

Испытуемый и стандартный раствор наносят микропипет­ кой объемом около 3 мкл, что обеспечивает оптимальный раз­ мер исходного пятна. Большой диаметр пятен приводит к воз­ никновению диффузных и размытых пятен аминокислот после проявления. При необходимости нанесения больших количеств раствора используют повторное нанесение в одну и ту же точ­ ку. После нанесения на точку порции раствора пятно высуши­ вают, используя при этом ручной вентилятор типа ФЭН.

Разделение аминокислот проводят на одномерной хромато­ грамме путем многократного пропускания растворителя. Это позволяет получить четкое разделение аминокислот.

После нанесения гидролизатов на хроматографическую бу­ магу берут по два листа и зажимают их между стеклянными палочками выше места нанесения примерно на 3 см от верх­ него края, так, чтобы листы были обращены друг к другу ли­ цевой стороной. Затем верхние концы листов вставляют в про­ резь ванночки. Свободные концы бумаги поочередно перебра­ сывают через стеклянные палочки-плечики по обе стороны ванночки. Камеру закрывают как можно плотнее. Через одну из воронок в крышке камеры наливают насыщающий камеру раствор в эмалированную кювету на дне камеры, а через дру­ гую воронку заправляют ванночку растворителем. Воронки закрывают резиновыми пробками.

В качестве растворителя используют смесь п-бутилового спирта, ледяной уксусной кислоты и воды в соотношении 4:1:1. Неплохие получают результаты при соотношении этих компонентов в растворителе 4:1:5. Первый растворитель не расслаивается и его используют, целиком; второй применяют после расслоения — верхний слой — как подвижный раствори­ тель, нижний —для насыщения камеры.

99