Файл: Методики постановки опытов и исследований по молочному хозяйству [сборник]..pdf

Хроматограмму после первого пропускания растворителя просушивают на воздухе под тягой. Затем вновь помещают в ванночки для следующего пропускания растворителя. Луч­ шие результаты получают при 3—4-кратном пропускании рас­ творителя по длине листа.

Аминокислоты под действием растворителя передвигаются с разной скоростью и разделяются. Когда растворитель дой­ дет до конца бумаги, аминокислоты будут находиться на опре­ деленных местах соответственно Rf-коэффициенту скорости их распределения. Коэффициент скорости передвижения каж­ дой аминокислоты при определенной температуре для одной и той же бумаги и растворителя является постоянной вели­ чиной.

Т а б л и ц а 17

Rf аминокислот n-бутанолового растворителя (n-бутанол, уксусная кислота, вода- — 4: 1: 1)

Хроматограмму сушат до исчезновения запаха раствори­ теля и проявляют. Для этого лист смачивают в фотографиче­ ской кювете 0,5%-ным раствором нингидрина в ацетоне. После 3—5-минутного проветривания на воздухе хроматограмму про­ гревают в термостате в течение 15 мин. при 60—65°. На хро­ матограмме появляются пятна аминокислот, окрашенные в сине-фиолетовый цвет, за исключением пролина, который окра­ шивается в желтый цвет.

Просушенную хроматограмму после обработки нингидрином смачивают раствором азотнокислой меди. Вследствие пе­ рехода нингидринового комплекса в медный пятна окраши­ ваются в оранжево-красный цвет. Окрашенные пятна амино-

100

четкое разделение всех 18—20 аминокислот в стандартном растворе удается не всегда.

Первый стандарт состоит из цистина, гистидина, аспараги­ новой кислоты, глицина, метионина, фенилаланина, изолейци­ на по 5 мг каждой и 10 мг пролина; второй — из аргинина, се­ рина, аланина, тирозина по 5 мг и по 10 мг лизина, глутами­ новой кислоты и лейцина. Перед приготовлением стандартов препараты высушивают до постоянного веса при 100—105°, за исключением глутаминовой кислоты, которую сушат в ва­ куум-эксикаторе, так как при нагревании она разрушается. Аминокислоты в абсолютно сухом состоянии взвешивают на аналитических весах, растворяют в бидистилляте, подкисляют 2 каплями концентрированной соляной кислоты и доводят объем мерной колбы бидистиллятом до 10 мл.

Стандартные смеси наносят на лист хроматографической бумаги и проводят те же операции, что и при работе с гидро­ лизатом. После завершения процесса хроматографии и прояв­ ления аминокислот их идентифицируют.

Для построения калибровочного графика на бумагу нано­ сят аминокислоты в количестве 4, 8, 12, 16 мкг. По данным оптической плотности вычерчивают калибровочные графики.

Формула для расчета количества аминокислот:

где х — содержание аминокислот в белке (%); а — количество аминокислоты в пятне (мкг), найденное по калибровочному графику или по расчету; б — общий объем гидролизата (мкл);

После гидролиза конечный объем этой навески 25 мл. Гидро­ лизат и смесь-стандарт, в 10 мл которой 5 мг метионина, на­ несли на бумагу одной и той же микропипеткой (в 3 мкл стан­ дартного раствора содержится 1,5 мкг метионина). После раз­ деления, проявления, элюирования и фотоколометрии экстинкция пятна метионина в гидролизате—0,065, а в смеси-стандарте

0,025.

Количество метионина в пятне гидролизата =

102

Оборудование и материалы

Хроматографические камеры (рис. 17). В качестве камер используют сосуды различной формы и размеров, сделанных из материалов, с которыми растворитель не реагирует. Для нисходящей хроматографии удобны стеклянные камеры, в них

Рис. 17. Камера для хроматографии: 1 — корпус камеры; 2 — ванночки стеклян­

ные; 3 — плечики ванночки; 4 — листы хро­

матографической бумаги

легко следить за движением растворителя. Часто применяют застекленные со 'всех сторон ящики. Деревянную рамку из-* нутри тщательно парафинируют, а снаружи прошпаклевывают и покрывают масляной краской. С боков прикрепляют выпи-

103

ленные из фанеры держатели для ванночек и плечиков. Крыш­ ка камеры крепится с помощью замков типа зажимных. Ме­ жду крышкой и камерой резиновая прокладка, позволяющая создать герметичность в камере. В средней части крышки укрепляют с помощью парафина стеклянные воронки с проб­ ками. Воронки должны быть расположены против щелей ван­ ночки и служат для внесения растворителя без открывания

крышки, это не нарушает насыщенность камеры парами рас­ творителя.

Рис. 18. а) Схема использования ванночки для по­

лучения хроматограмм:

1 — ванночка; 2 — плечики; 3 — листы бумаги; 4 —

предметные стекла-держалки.

б) Столик для нанесения на хроматограммы боль­

шого числа проб. в) Микропипетка,.

Размеры хроматографической камеры следующие: длина 60 см, ширина 40 см, высота 60 см. В камере устанавливают три ванночки, длина щелей которых около 50 см. В такой ка­ мере можно получать одновременно 12 хроматограмм разме­ ром 25x65 см (рис. 18). При восходящей хроматографии ис­ пользуют стеклянные колпаки, а также высокие стеклянные банки с пришлифованной стеклянной крышкой. В случае кру-

104

говой хроматографии в качестве камер используют эксикато­ ры, парные кристаллизаторы, чашки Петри.

Хроматографические кюветы. Кювета, или ванночка, пред­ ставляет собой стеклянную трубку, запаянную с концов. Диа­ метр трубки не менее 2 см, длина определяется размером ка­ меры. Кювета имеет продольную щель шириной от 0,5 до 1,5 см. Для установки ванночек в камеры на концах их припаивают Т-образные отростки. Плечики, которые поддерживают хроматограммы, делают из стеклянных палочек или трубок диаметром 5 мм. С целью увеличения количества хромато­ грамм к ванночке или кювете придают 2—3 пары плечиков, при этом количество хроматограмм увеличиватся в 2—3 раза.

Автоматические микропипетки. Для точного нанесения ис­ следуемой пробы используют автоматические пипетки. Объем пипетки не больше 2—5 мкл. Определение объема (калибров­ ка) капилляра микроавтопипетки производят путем взвешива­ ния нескольких объемов воды из капилляра на фильтровальной бумаге. Для этого на кусочек взвешенной плотной фильтро­ вальной бумаги выдувают содержимое пипетки. Бумагу тот­ час же взвешивают на микровесах. Определение повторяют 5—6 раз. За истинный объем пипетки принимают среднюю величину.

Сушильный шкаф. Для проявления окраски при реакции аминокислот с нингидрином хроматограммы высушивают при температуре 60—65°. Для этого используют сушильные шка­ фы или термостаты с регулятором температуры. Для работы удобны большие сушильные шкафы, в которых хроматограм­ мы размещаются свободно.

Бумага. Из отечественных сортов для хроматографического анализа пригодна бумага марки Б — «быстрая» и М — «мед­ ленная», номера 1, 2, 3 и 4. Из иностранных наиболее широко применяют английскую бумагу ватман № 1 и 3, немецкую — бумага № 598 (Шлейхер и Шуль), а также чехословацкую. Бу­ магу этих марок используют для анализа аминокислот без предварительной обработки. Хроматографическая бумага дру­ гих марок часто бывает неоднородна по качеству, поэтому скорость движения растворителя по ней неодинакова. В связи с этим бумагу перед анализом необходимо проверить на ско­ рость движения растворителя. Растворитель через бумагу про­ пускают в течение 18—20 час., затем ее высушивают при ком­ натной температуре и сортируют -по скорости движения рас­ творителя.

105

VIII. ИССЛЕДОВАНИЕ МОЛОКА И СЫРА В ПРОЦЕССЕ ЕГО ВЫРАБОТКИ

Н. В. БАРАБАНЩИКОВ

Сычужная свертываемость молока. Время от момента вне­ сения раствора сычужного фермента до образования сгустка характеризует свертываемость молока.

В три пробирки отмерить по 10 мл средней пробы молока. Пробирки установить в баню при 32°. Необходимо, чтобы тем­ пература 'В бане была постоянной и контролировалась термо­ метром, установленным в одной из пробирок. В две другие про­ бирки с молоком вводят по 1 мл раствора сычужного фермен­ та (t32°). Каждую из пробирок закрывают пробкой, три раза перевертывают для размешивания, пробки удаляют и пробир­ ки ставят в баню. По секундомеру отмечают время начала опыта и наблюдают за ним до момента образования хлопьев.

Период от момента введения сычужного фермента до по­ явления хлопьев называется фазой коагуляции казеина. Появ­ ление хлопьев обнаруживают с помощью тонкой стеклянной палочки, которую время от времени опускают в молоко. По капле, стекающей с палочки и нанесенной на стенку пробирки, судят об образовании хлопьев.

Далее важно установить промежуток времени от момента появления хлопьев до образования плотного сгустка, который называют фазой гелеобразования. Для этого берут другую про­ бирку и время от времени ее наклоняют, следя за образова­ нием сгустка. Концом фазы гелеобразования считают момент, когда при опрокидывании пробирки поверхность сгустка лишь незначительно деформируется.

Время с момента введения раствора сычужного фермента до образования плотного сгустка (фаза коагуляции + фаза гелеобразования) характеризует продолжительность сверты­ вания молока,

107

Пр и м е р . По секундомеру зафиксировано время с момен­ та введения в молоко раствора сычужного фермента до обра­ зования хлопьев (фаза коагуляции)— 24 мин., а продолжи­ тельность периода с момента образования хлопьев до готов­ ности сгустка (фаза гелеобразования) — 5 мин. Следователь­ но, продолжительность свертывания молока сычужным фер­ ментом 29 мин. (24+ 5).

Т а б л и ц а 18

Запись результатов анализа

В среднем молоко свертывается в пределах от 15 до 35 мин. Однако зафиксированы случаи, когда отдельные образцы мо­ лока свертываются в течение 5 мин., а другие вообще не свер­ тываются.

П р и б о р ы и р е а к т и в ы : баня водяная, термометр, секундомер, раствор сычужного фермента.

Приготовление раствора: 1 г сычужного порошка раство­ ряют в 100 мл смеси воды и глицерина в равных количествах. Спустя 24 часа основной раствор фильтруют через складчатый' фильтр и хранят в темном месте, пользуясь им не более 5 су­ ток. Перед анализом готовят рабочий раствор, разбавляя ос­ новной в 25 раз.

Плотность и эластичность сычужного сгустка. Определяют максимально разрушающее усилие, необходимое для «раска­ лывания» сгустка, которое характеризует его плотность. Одно­ временно устанавливают сопротивление, оказываемое сгуст­ ком на воздействующую разрушающую силу. Последнее ха­ рактеризует «эластичность сгустка». Исследования проводят на гелеометре.

В химический стакан отмеривают 0,5 л исследуемого мо­ лока при температуре 32° и устанавливают его в термостат при той же температуре. В молоко вносят 25 мл рабочего рас-

108