Файл: Сикорский, З. Технология продуктов морского происхождения.pdf

многократного селективного диализа, но обычно осаждение бел­ ка сопровождается агрегированием частичек.

Миозин обладает способностью растворяться в растворах хлористого калия при концентраци 0,15 М и выше, зато при низ­ кой ионной силе во время ассоциации молекул образуются поли­ меры нитевидной структуры. Ассоциация молекул происходит также в сырье с ионной силой, превышающей 0,5. На образова­ ние комплексов, кроме ионной силы, оказывают влияние pH и давление. Присутствие ЕДТА, АТФ, ортофосфата и меркаптоэтанола уменьшает способность миозина к ассоциации. По данным Конелла, лучшим способом выделения миозина из гомогената, препятствующим его агрегированию, является предшествующее вымывание миогена, экстракция оставшейся части нейтральным раствором соли с ионной силой 0,6 (раствор содержит пирофос­ фаты) с последующим десятикратным разведением экстракта дистиллированной водой и быстрым растворением выпадающего при таких условиях осадка миозина и актомиозина в растворе соли с ионной силой 0,4. Сопутствующий актомиозин выпадает в осадок, уменьшая концентрацию раствора до ионной силы 0,23 [24].

Миозин составляет 30—40% от общего количества белков мя­ са. Молекулярный вес миозина по Дайеру колеблется от 530 000

до 590 000, а по Конеллу— от 500 000 до 530 000 [24]. Молекуляр­ ный вес миозина форели, вычисленный по аминокислотному со­ ставу, равен 500 027 ±44 [19]. Изоэлектрическая точка миозина находится при pH 5,4. Миозин хорошо связывает двухвалентные катионы кальция и магния, слабее — катионы натрия и калия.

Предложено несколько моделей строения молекулы миозина. Существует мнение, что мономер миозина состоит из двух глав­ ных полипептидных цепей, имеющих структуру а*спирали. Цепи расположены равномерно. Каждый из полипептидов заканчива­ ется глобулярный фрагментом, связанным водородными связями с дополнительной короткой полипептидной цепью. Эти глобуляр­ ные структуры с короткими полипептидными спиралями образу­ ют так называемые головки миозина. Хаксли на основании ис­ следований при помощи электронного микроскопа установил, что длина мономера миозина составляет 125+26 нм, длина головки 15—25 нм, диаметр более тонкого конца 1,5—2 нм, а диаметр головки 4 нм.

Под воздействием трипсина миозин может быть расщеплен

ловка.

Миозин играет очень важную биологическую роль в системе, так как обладает способностью связываться с актином и выпол­ нять функции фосфогидролазы АТФ. Его АТФ-азная активность увеличивается в присутствии ионов кальция и уменьшается с ро-

Рис. 7. Переваривание мио­

Продолжительность гидролиза, мин

стом концентрации ионов магния. Зато в присутствии актина, когда при низкой ионной силе образуется комплекс этого белка с миозином, ионы магния также активируют гидролиз АТФ.

Этой биологической активностью наделена головка молекулы миозина, тогда как L-меромиозин обладает способностью к об­ ратной ассоциации, благодаря чему образуются волокна миози­ на. Максимум миозиновой активности фосфогидролазы АТФ ус­ тановлен при pH 6,5, а также при pH 10.

Биологическая роль миозина зависит от присутствия в разных частях молекулы тиоловых групп (I. Kkol: Grupy tiolowe miozyny a jej struktura i funkcje. PWN, Warszawa, 1972). В ходе многочисленных исследований, в которых на Миозин воздейство­ вали различными соединениями, имеющими неодинаковое срод­ ство с тиоловыми группами, установлено, что блокирование лег­ ко реагирующих групп — SH вызывает значительную (четырех­ кратную) активацию Са2+ АТФ-азы, зато связывание труднее реагирующих тиоловых групп обусловливает полную инактива­ цию фермента. Группы — SH, которые реагируют со специфич­ ными реактивами лишь после разрушения структуры белка треть­ его порядка, не оказывают существенного влияния на фермента­ тивную активность миозина.

Установлено также, что фракция миозина, выделенная из мышц радужной форели, обнаруживает активность гидролазы ацетилхолина [18].

Миозин трески и других рыб значительно отличается по сво­ им свойствам от миозина млекопитающих и птиц (рис. 7). Он легче подвергается денатурации под влиянием нагревания и под воздействием мочевины, скорее переваривается пепсином и хи-

36

мотрипсином и содержит больше легко окисляющихся тиоловых

групп.

Выделение актина заключается в осаждении его из раствора хлористого калия путем добавления воды, с последующим раст­ ворением осадка в 0,6 М растворе йодистого калия, содержащем АТФ и аскорбиновую кислоту, а сопутствующий миозин выделя­ ют путем осаждения его этиловым спиртом. Актин может присут­ ствовать в растворе в глобулярной форме (G-актин) или обра­ зовывать более вязкие растворы фибриллярного полимеризованного актина (в форме F) под воздействием хлористого калия. F-актин подвергается деполимеризации посредством диализа или при добавлении йодистого калия. G-актин в мясе рыбы свя­ зан с АТФ, который присутствует в количестве 1 моля на 1 моль белка.

В процессе полимеризации при переходе в F-актин имеет ме­ сто дефосфорилирование АТФ, при этом образовавшийся АДФ остается связанным с белком [84]. Если от G-актина отделяет­ ся АТФ, белок теряет способность образовывать фибриллярную форму, однако с L-миозином может образовывать актомиозин, не содержащий АТФ. Такой актомиозин не имеет свойств энзима АТФ-азы, в отличие от актомиозина, образованного из G-актина, содержащего АТФ и миозин.

Нуклеотид, связанный с G-актином, необходим для надеж­ ного выполнения функций актина или, как отмечают Томлинсон и Гейгер [84], для предотвращения изменений белка, сопровож­ дающихся утратой этих функций. Связанный нуклеотид не раз­ лагается под воздействием ферментов, вызывающих посмертные изменения свободных нуклеотидов в мышцах.

Содержание актина в мышечных тканях составляет 15—20% от общего количества белка. Его изоэлектрическая точка нахо­ дится при pH 4,7, молекулярный вес порядка 130 000.

Актомиозин — это комплекс актина и миозина, который мож­ но выделить из мышц раствором соли небольшой ионной силы. Порог растворимости актомиозина трески и карпа находится при ионной силе раствора р=0,25. Молекулярный вес актомиозина трески около 60 — 80 • 106, а молекулярный вес актомиозина кар­ па 40-106. На основании физико-химических измерений вычисле­ но, что молекула актомиозина карпа имеет вид эллипсоида раз­ мером 120-0,8 мкм [33].

После смешивания чистых растворов актина и миозина обра­ зуется актомиозиновый комплекс, который, вероятно, по некото­ рым свойствам отличается от актомиозина, присутствующего в мышцах. Растворы актомиозина обнаруживают значительное уменьшение вязкости под действием АТФ, что указывает на уменьшение размера его молекул [77]. Удаление АТФ из среды вызывает увеличение вязкости раствора. Актомиозин, как и миозин, способен отщеплять один остаток фосфорной кислоты от молекулы АТФ. Актомиозин, присутствующий в мышцах ры­

37

бы, содержит АДФ, по-видимому, связанный с молекулой акти­ на.

Т. Тагути и С. Икеда установили, что очищенный препарат актомиозина разных видов рыб содержит постоянное количество лецитина, свободно связанного с белком. Оказывается лецитин стимулирует активность актомиозиновой фосфогидролазы АТФ [80]. Этот фермент подвергается активации под действием леци­ тина, тогда как воздействие препаратов холинфосфогидролазы подавляют энзиматическую активность. Повторное введение ле­ цитина в среду восстанавливает действие фосфогидролазы АТФ.

Тропомиозин выделяют экстракцией предварительно высу­ шенных мышц рыб органическими растворителями или непо­ средственно экстракцией растворами соли разной концентрации и pH. Эта фракция составляет от 1,8 до 3,0% от общего коли­ чества белка мышц. Молекулярный вес тропомиозина трески

из двух частей.

Б е л к и с о е д и н и т е л ь н о й т кани . В состав этих белков входят коллаген, ретикулин и эластин. Коллаген является глав­ ным компонентом шкуры, а также плавательного пузыря и стро­ ительным материалом соединительной ткани в мышцах.

При разделении белков мяса рыбы на фракции коллаген

иэластин остаются в нерастворимой в воде фракции и в приме­ няемых для экстракции растворах соли. Экстрагируя белок пик­ ши от 0,005 до 0,05 н. раствором соляной кислоты и от 0,05 до 0,1 н. раствором хлористого натрия, Рэй получил около 4% так на­ зываемой стромы, которая почти целиком состоит из коллагена

исодержит минимальные примеси эластина [73].

По химическим и физическим свойствам коллаген, получен­ ный из различного сырья, очень близок [40, 42, 43, 74].

Коллаген, построенный из 19 аминокислот, характеризуется необычно высоким содержанием глицина, пролина и аланина, присутствием 3 и 4-гидрооксипролина и гидрооксилизина, не об­ наруживаемых в белках мышечного волокна, а также низким содержанием незаменимых аминокислот. В коллагене нет трип­ тофана и серуеодержащих аминокислот — цистеина и цистина. Четыре компонента, превалирующих в коллагене — глицин, пролин, аланин и оксипролин — составляют 60% общего содержа­ ния аминокислот в этом белке. Кроме того, в коллагене обнару­ жено от 0,5 до 1 % гексоз, главным образом глюкозы и галакто­ зы, а также манноза и фруктоза и от 0,25 до 0,5% глюкозамина. В сухом веществе ихтиокола содержится от 0,35 до 0,45% глю­ козы и галактозы (в соотношении 1 : 1,5). Нейтральные сахара постоянно связаны в коллагене, тогда как гексозамины можно почти целиком выделить действием щелочей.

38

Структура нативного коллагена, содержащегося в соедини­ тельной ткани, очень сложна, так как заключает пять очеред­ ных ступеней (порядков).

Структура первого порядка, заключающаяся в последова­ тельности аминокислот в полипептидной цепи, окончательно еще не установлена. Известно, что в состав полипептидных цепей кол­ лагена входят полярные и неполярные участки, размещенные не­ равномерно. При просмотре через электронный микроскоп они видны как светлые и темные полоски. В неполярных участках преобладает следующая последовательность аминокислот: гли­ цин, пролин, оксипролин. Пролин также в большой степени свя­ зан с основными аминокислотами.

Пространственное строение (конформация) главных полипеп­ тидных цепей в коллагане, т.е. структура второго порядка типа спирали левого вращения. Участки спирали с относительным мо­ лекулярным весом 27 000, так называемые подгруппы, соедине­ ны вдоль эфирными связями, в которых участвуют аспарагино­ вая кислота и углевод. Четыре подгруппы образуют единичную цепь с молекулярным весом 110 000 (компонент а).

Стабилизация такого пространственного построения второго порядка наступает благодаря тому, что три компонента а обра­ зуют совместно спираль правого вращения (структура третьего порядка), а между цепями имеются водородные связи. На три остатка аминокислоты приходится, вероятно, два водородных мостика между пептидными группами соседних цепей.

Три связанных компонента а являются макрочастицей тропоколлагена длиной от 280 до 300 нм, толщиной от 1,2 до 1,5 нм и молекулярным весом от 330 000 до 350 000. Сразу после обра­ зования тропоколлаген не имеет внутримолекулярных попереч­ ных ковалентных связей, однако по мере старения образуется пространственная решетка. Существует мнение, что в построении внутримолекулярной сети принимают участие альдегидные груп­ пы соседних цепей, вступающие в реакцию альдоловой конден­ сации, а также создаются о-гликозидные и эфирные связи при участии гексоз.

По мнению некоторых исследователей, эфирные связи, а так­ же связи, сформированные при реакции альдегидных групп, создаются главным образом между соответствующими амино­ кислотами, входящими в состав телопептидов. Телопептиды — это участки пептидов, размещенные на концах или по бокам главных цепей и содержащие в основном тирозин, входящий в состав коллагена. В этих участках нет оксипролина. Следует отметить, что относительный молекулярный вес телопептидов составляет примерно У20 молекулярного веса тропоколлагена. Телопептиды подвергаются отщеплению под действием фермента проназы, при этом наблюдается уменьшение вязкости раствора тропоколлагена и разрушение поперечных связей между моле­ кулами а.

39