Файл: экз патан кафедра 1 (2).docx

Гени-супресори пухлинного росту (tumor suppressor genes), на відміну від прото-онкогенів, відповідають за негативний контроль проліферативної активності клітини і  гальмують її поділ у разі надходження відповідного сигналу, а в крайньому випадку можуть ініціювати програмовану загибель клітини – апоптоз. Такими сигналами зазвичай слугують: (1) пошкодження ДНК або поява інших помилок поділу клітини в S чи M фазах клітинного циклу; (2) контактне ігібування розмноження клітин в обмеженому просторі; (3) відсутність ростових факторів або недостатнє надходження поживних речовин.

Що таке неоангіогенез, яка група генів контролює цей процес?

Неоангіогенез – формування сітки капілярів з ендотеліальних клітин , які вистилають дрібні венули – необхідна умова для подальшого росту пухлинного вузлика , який досяг діаметру більше 2-4мм. Це суворо регульований процес , який збалансований дією ряду про та антиангіогенних факторів , який веде до формування нової розширеної судинної сітки там , де раніше її не було.

Ген Vascular endothelial growth factor (VEGF) – головний медіатор неоангіогенеза. Важливими пусковими факторами для посилення продукції VEGF пухлиною, є онкогени ( такі як ras, VHL, bcl-2). VEGF впливає на розвиток нових кровоносних судин (ангіогенез) і виживання незрілих кровоносних судин (судинна підтримка), зв'язуючись з двома близькими за будовою мембранними тірозінкіназними рецепторами (рецептором-1 VEGF і рецептором-2 VEGF) і активуючи їх. Ці рецептори експресуються клітинами ендотелію стінки кровоносних судин. Зв'язування VEGF з цими рецепторами запускає сигнальний каскад, стимулює ріст ендотеліальних клітин судини, їх виживання і проліферацію

Значення неоагнгіогенезу для прогресування пухлини.

Неоангіогенез – формування сітки капілярів з ендотеліальних клітин , які вистилають дрібні венули – необхідна умова для подальшого росту пухлинного вузлика , який досяг діаметру більше 2-4мм. Це суворо регульований процес , який збалансований дією ряду про та антиангіогенних факторів , який веде до формування нової розширеної судинної сітки там , де раніше її не було.

Ген Vascular endothelial growth factor (VEGF) – головний медіатор неоангіогенеза. VEGF впливає на розвиток нових кровоносних судин (ангіогенез) і виживання незрілих кровоносних судин (судинна підтримка), зв'язуючись з двома близькими за будовою мембранними тірозінкіназними рецепторами (рецептором-1 VEGF і рецептором-2 VEGF) і активуючи їх.За відсутності ростових сигналів ендотеліальні клітини незрілих кровоносних судин піддаються запрограмованій клітинній загибелі (апоптозу). VEGF перешкоджає апоптозу ендотеліальних клітин в незрілих кровоносних судинах, тим самим зберігаючи їх життєздатність. VEGF стимулює проникність дрібних кровоносних судин. Підвищена проникність веде до підтікання білків плазми через стінку судини і формуванню екстравазального фибринового гелю. Цей гель являє собою сприятливе середовище для росту клітин ендотелію. У присутності високих концентрацій VEGF, характерних для онкологічних захворювань, судини набувають надзвичайно високої проникності і схильності до підтікання. Наслідком цього є високий интерстициальний тиск в пухлині і нерівномірна доставка в пухлину поживних речовин, кисню і лікарських препаратів – неефективне лікування. За відсутності судинної мережі пухлини залишаються дрібними .Злоякісні пухлини піддаються «ангіогенному переключенню», що порушує баланс між про- та антиангіогенними факторами, зазвичай завдяки посиленню секреції ростових факторів. Більшість ростових факторів, а також низький рН і низькі концентрації кисню, що виявляються в пухлини, стимулюють експресію VEGF, який потім активує експресію інших ланок ангіогенезу, таких як металлопротеінази і молекули клітинної адгезії. Тим самим VEGF діє як ключовий медіатор пухлинного ангіогенезу, стимулюючи зростання нових кровоносних судин з довколишніх капілярів і даючи пухлини доступ до кисню і поживних речовин, в яких вона потребує для свого зростання і метастазування.

Значення апоптозу для формування пухлини. Методика визначення мутації гену р53 та його протеїну.

Порушення нормального апоптозу клітин призводить до неконтрольованого розмноження клітини і появи пухлини.

Регуляція цього типу клітинної загибелі здійснюється завдяки функціонуванню численних онкогенів та антионкогенів, або супресорів пухлин. Перші за певних умов здатні запускати проліферацію клітин або блокувати клітинну загибель, завдяки односпрямованій дії вони ініціюють неопластичне переродження тканини. У відповідь на пошкодження ДНК, які не піддіаються репарації, білок р53 індукує зупинку клітинного циклу і викликає апоптоз, завдяки чому відбувається видалення клітин з ураженнями генетичного апарату, спонтанними чи індукованими. У р53-дефіцитних клітинах зупинки клітинного циклу не відбувається, вони втрачають здатність реалізувати процес програмованої загибелі. Замість утрати кількість анормальних клітин збільшується, що насамперед призводить до метастазування пухлин. Саме мутаціями в гені р53 і частково гіперекспресією антиапоптозних генів родини Всl пояснюється формування лікарської резистентності пухлинних клітин до тих лікувальних впливів, дія яких базується на індукції апоптозу (хемо та радіотерапії).

У багатьох пухлинах інтенсивність апоптозу прямо пов’язана з прогресією, зменшенням ступеня зрілості клітин, типом пухлини. Апоптоз контролюють ті самі цитокіни, протоонкогени і гени-супресори росту пухлин, які контролюють процеси проліферації і диференціювання клітин. Всі ці процеси тісно взаємопов’язані під час прогресування росту пухлини, коли часто виявляють гіперекспресію клітинних онкогенів з мутацією генів-супресорів.

ІГХ-методи. ІГХ-дослідження експресії р53 проводиться з використанням відповідних моноклональних антитіл на парафінових зрізах пухлинної тканини. Зрізи товщиною 4–5 мкм д парафінують у ксилолі та регідратували у серії спиртів, після чого препарати занурюють у дистильовану воду. Ендогенну пероксидазу блокували 3% водним розчином Н2О2. В якості субстрат-хромогену використовують 3,3′-діамінобензидин тетрагідрох-лорид (ДАБ). Після виявлення активності пероксидази препарати дофарбовували гематоксиліном Мейєра протягом 2–3 хв Для ІГХ-виявлення білка р53 застосовували полімер-пероксидазний метод (EnVision+/HRP). Як первинні антитіла використовували МкАТ проти р53 (IgG2b, клон DO-7,. Для негативного контролю використовували IgG2b . У ролі позитивного контролю слугували МкАТ проти цитокератинів . Слід зазначити, що МкАТ клону DO-7 реагують як з білком дикого, так і мутантного типу. На відміну від білка р53 дикого типу (період напіврозпаду до 20 хв), мутантний білок р53 є більш стабільним (період напіврозпаду до 24 год), що призводить до його накопичення переважно в ядрі і можливості виявлення ІГХ-методом .Оцінку результатів ІГХ-дослідження проводять за допомогою світлового мікроскопа (збільшення х 400). Застосовували наступні критерії оцінки: пухлинні клі- тини класифікували як позитивні, якщо після виконання ІГХ-реакції було виявлено ядерне забарвлення; результати ІГХ-забарвлення р53 оцінювали напівкількісним методом: у кожному препараті підраховували ≈ 1000 клітин і визначали відсоток р53- позитивних клітин; пухлину вважали негативною (–) за експресією р53, якщо в тканині пухлини була відсутня ядерна реакція з відповідними антитілами або кількість забарвлених клітин була < 10%; і позитивною (+), якщо спостерігали ядерне забарвлення в ≥ 10% пухлинних клітин.

Методика визначення ампліфікації гена HER-2/neu, в яких раках це визначення обов’язково?

На 2019 рік існують 4 тести для виявлення підвищеної експресії HER2

1. IHC (англ. ImmunoHistoChemistry) –Імуіногістохімічне дослідженнядослідження (ИГХ)

2. FISH (англ. Fluorescence In Situ Hybridization) - Флуоресцентна гібридизація in situ

3. SPoT - Light HER2 CISH (англ. Subtraction Probe Technology Chromogenic In Situ Hybridization) - Хромогенна гібридизація in situ

4. Inform HER2 Dual ISH test (англ. Inform Dual In Situ Hybridization)

Також для такої діагностики може використовуватися аналіз ДНК пухлинних клітин методом ПЦР, перевагою методу є можливість використання архівних зразків пухлини, що зберігаються в парафінових блоках.

Надійним методом виявлення ампліфікації гена Her2/neu являється флуоресцентна гібридизація in situ (FISH) - золотий стандарт в діагностові Her2/neu- позитивний рак. Результат тесту є позитивним, якщо співвідношення середньої кількості копій гена Her2/neu і середнього числа центромер хромосоми 17 в клітині перевищує 2,2.

Також рівень експресії білка Her2/neu можна визначся за допомогою Вестерн-блоттинга, методів імунного фарбування in situ, зокрема імунофлуоресцентного (іФ) і імуногістохімії (ІГХ) .ІГХ метод знайшов широке застосування у зв'язку з тим, що повсякденно використовується для оцінки експресії багатьох інших протеїнів і може бути виконаний на зрізах парафінових блоків тканини, фіксованихї формаліном; результат є позитивным- 3+, якщо більше 30% клітин інвазивної пухлини демонструють рівномірне фарбування мембрани.

Можливі псевдопозитивні результати, обумовлені технічною недосконалістю методу. Крім того, гіперекспресія протеїну може бути і незв'язаною з ампліфікацією гена Her2/neu. Можливі і псевдонегативні результати тесту. В деяких випадках, після заливки в парафін, тканини раку, що характеризуються ампліфікацією гена Her2/neu і гіперекспресією відповідного білку, можуть втрачати рецептори на поверхні мембрани і втрачати здатність давати специфічне фарбування при проведенні ІГХ-дослідження.

Надмірна експресія пухлиною HER - 2/neu служить незалежним маркером несприятливого прогнозу, підвищеного ризику рецидиву захворювання Визначення надмірної експресії HER - 2/neu має велике значення при раку молочної залози (РМЖ). Підвищена експресія цього білку також спостерігається в клітинах раку яєчників, шлунку і матки,підшлункової з-зи,передміхурової з-зи,нирок,товстої кишки.

Які види росту пухлин існують на макроскопічному рівні? Їх характеристика та приклади.

Види росту пухлин , які ми можемо віддеференціювати неозброєним оком

1. Експансивний. Пухлина росте «сама з себе», розсовуючи навколишні тканини. Паренхіма пухлини атрофується, розвивається колапс (спадіння) строми, й пухлина ніби оточується капсулою (псевдокапсулою). Експансивний ріст пухлини повільний і характерний для доброякісних пухлин. Однак, деякі злоякісні пухлини також можуть рости експансивно (рак нирки, щитоподібної залози, фібросаркома).

2. Інвазивний (інфільтруючий). Клітини пухлини вростають у навколишні тканини та руйнують їх. Інвазія відбувається в напрямку найменшого опору (по міжтканинним щілинам, за ходом судин, нервів). Пухлинні клітини руйнують стінки судин. Якщо на шляху інвазії пухлини зустрічається капсула органа або інші щільні тканини, то пухлинні клітини спочатку поширюються по їхній поверхні, а після, проростаючи капсулу, проникають вглиб органа. Межа пухлини при інвазивному рості визначаються нечітко. Інвазивний ріст пухлини швидкий і характерний для злоякісних пухлин. Виділяють також місцеводеструктивний ріст, при якому пухлина інфільтрує та руйнує навколишні тканини, але нездатна поширюватися по всьому організму

3. Апозиційний ріст пухлини відбувається за рахунок неопластичної трансформації нормальних клітин в пухлинні, що виявляють у пухлинному полі. Прикладом такого росту можуть служити десмоїди (фіброматози) передньої черевної стінки

4. Ендофітний. Це інфільтруючий ріст пухлини вглиб стінки порожнистого органа. При цьому пухлина з поверхні слизової оболонки (наприклад, шлунка, сечового міхура, бронха, кишки тощо) непомітна, її вдається виявити тільки на розрізі. (виразковоінфільтративний, стенозуючий рак стравоходу)

5. Екзофітний. Це експансивний ріст пухлини в просвіт порожнистого органа. Пухлина при цьому може заповнювати значну частину порожнини, з’єднуючись зі стінкою ніжкою. (поліпоподібний, блюдцеподібний рак стравоходу)

6. Уніцентричний. Один осередок пухлини.(гепатоцелюлярний рак)

7. Мультицентричний. Кілька пухлинних осередків.(сосочкова форма раку молочної залози)

Види росту фіброміоми та лейоміосаркоми матки? Як це виглядає макроскопічно та мікроскопічно?

Фіброміома – доброякісна пухлина що розвивається із сполучної (фіброзної) тканини.

• Щільна – з перевагою колагенових пучків над клітинами

• М’яка – складається із пухкої тканини з великою кількістю клітин типу фібробластів.

Ріст – експансивний, тобто пухлина росте, не руйнуючи оточуючі тканини, а відштовхуючи їх.

Види росту за локалізацією:

• Інтрамуральні (знаходяться між м'язовими шарами). Виявляються в товщі стінки матки.

• Субмукозні (розташовані під слизовою оболонкою). Розташовуються ближче до порожнини матки і деформують її. Найчастіше супроводжуються кровотечами.

• Субсерозні (знаходяться під очеревиною).

• Інтралігаментарні (міжзвязкові). Розташовані в товщі широкої зв'язки матки.

Макроскопічно має вигляд вузла з чіткими межами і формою, різного розміру. Мікроскопічно – пухлина побудована із диференційованої сполучної тканини, пучки волокон і судин розташовані в різних напрямках.

Лейоміосаркома – злоякісна пухлина мезенхімального походження з гладком’язових клітин, якій притаманний значний клітинний та тканинний атипізм, велика кількість мітозів.

Ріст інфільтративний, пухлина вростає в оточуючі тканини.

Макроскопічно: поодинокі інтрамуральні утворення з нечіткими межами. На розрізі вони представляють сіро-жовту або рожеву структуру, чітко спостерігаються зони крововиливів і некрозів.

Мікроскопічно складається з пучків веретеновидних клітин з рясною еозинофільною цитоплазмою. Ядра в клітинах - у вигляді веретена з закругленими кінцями, гіперхромні, з грубим хроматином і вираженими ядерцями. Приблизно в 25% пухлин можна чітко помітити інвазію судин. При мікроскопічному дослідженні характерною картиною є клітинна атипія, висока мітотична активність і некроз клітин пухлини.

Дайте морфологічну характеристику раку на клітинному та тканинному рівні.

Рак – злоякісна пухлина, що розвивається з малодиференційованих або недиференційованих клітин епітелію, якій властиві:

• Клітинний атипізм – буває вираженим різною мірою, стосується структури клітин, їх обміну, функцій, розмноження, антигенної структури, диференціювання, характеризується поліморфізмом або мономорфізмом ядер, появою патологічних фігур мітозів. Інколи може бути настільки вираженим що встановити структуру материнської клітини важко. Таким чином будова пухлини стає простішою, мономорфною.

• Тканинний атипізм характеризується порушенням тканинних співвідношень (паренхіми та строми), притаманних даному органу.

Характерний тип росту – інфільтративний, нечітке відмежування від навколишньої тканини або його відсутність. Розрізняють наступні форми раку: 1. "Рак на місці" – ріст пухлини відбувається в межах епітеліального пласта без порушення цілісності базальної мембрани. 2.Плоскоклітинний рак (зі зроговінням та без зроговіння) виникає на шкірі та слизових оболонках, покритих плоским епітелієм. 3. Аденокарцинома (залозистий рак) розвивається на слизових оболонках з порушенням цілісності базальної мембрани, на органах залозистої будови. 4. Слизовий (колоїдний) рак – клітини набувають перснеподібної форми, характерна гіперпродукція слизу, має вигляд слизової маси. 5. Солідний (трабекулярний) рак – відбувається формування тяжів, трабекул ракового епітелію з тонкими сполучнотканинними перетинками. 6. Дрібноклітинний рак, складається із недиференціованих мономорфних клітин з численними мітозами 7. Фіброзний (скір) рак складається з окремих груп виразно атипових клітин, розташованих між пластами сполучної тканини. 8. Медулярний (аденогенний) рак складається з пластів недиференційованих поліморфних клітин з численними фігурами мітозу.